《Food Innovation and Advances》：Influence of γ-irradiation and vacuum concentration on microbial compositions and shelf-life qualities of gallnut honey: a comparative study by multi-omics
编辑推荐：
中华蜜蜂（Apis cerana Fabricius）生产的五倍子蜂蜜（gallnut honey, GH）是中国四川凤通的地理标志产品。本研究系统比较了经γ辐照与真空浓缩处理（vacuum concentration treatment, VCT）后蜂蜜的微
中华蜜蜂（Apis cerana Fabricius）生产的五倍子蜂蜜（gallnut honey, GH）是中国四川凤通的地理标志产品。本研究系统比较了经γ辐照与真空浓缩处理（vacuum concentration treatment, VCT）后蜂蜜的微生物组成与特征风味物质，以揭示预处理对蜂蜜货架期品质的影响。高通量测序与菌落计数结果表明，尽管源于蜜蜂和花粉的益生菌（Apilactobacillus与Bombella）在新鲜采集的GH中占主导地位，但Enterococcus、Methylobacterium、Clostridium、Faecalibacterium及耐渗酵母（Hanseniaspora与Zygosaccharomyces）共同导致腐败。这些腐败相关类群对VCT造成的低含水量具有耐受性，但几乎被γ辐照（8 kGy）控制。感官评价、顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）及顶空-气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）检测表明，苯乙醛、异佛尔酮、苯乙醇、十二醛、丁香醛及酯类是GH的特征风味物质。VCT导致这些香气物质显著损失并伴随轻微风味劣变。相比之下，γ辐照维持了GH的香气并抑制了可能与微生物或酶促转化相关的不良挥发性有机化合物（VOCs），尽管其诱导了可能与脂质过氧化及美拉德相关途径有关的不良VOCs。
研究背景：蜂蜜因高渗透压、低含水量及过氧化氢（H?O?）、甲基乙二醛（MGO）、蜜蜂防御素-1等固有抗菌物质长期被视为耐贮藏食品，但由微生物及其毒性代谢产物引发的蜂蜜及含蜂蜜食品食物中毒事件不断出现。蜂蜜中微生物来源广泛，包括蜜蜂消化道、花粉、环境因子（土壤、空气、水等）及采集过程，其微生物组成及贮藏过程中的增殖情况尚不清晰，亟需精确揭示以支撑危害控制。低温真空浓缩处理（VCT）是维持蜂蜜货架期最常用的工业策略，但存在不确定的微生物风险；超高温（UHT）灭菌、高压灭菌、微波处理等虽被研究，但对热敏生物活性成分、风味物质及感官属性的负面影响限制了其应用。??Co-γ辐照作为一种安全可靠、穿透力强、操作温度低、残留少的非热食品杀菌技术，在蜂蜜微生物风险控制中具有潜在应用价值，但辐照通常诱导自由基反应改变食品化学组成，进而影响风味轮廓与活性成分，因此辐照后蜂蜜的感官特征、风味化合物及非挥发性成分需系统研究。本研究以8月采收、微生物负载较高的五倍子蜂蜜（GH）为对象，评价γ辐照的微生物去污效率，并通过与VCT比较，采用感官评价、高通量测序、HS-SPME-GC-MS及HS-GC-IMS研究γ辐照对GH感官特性、微生物组成及关键风味物质的即时与贮藏后影响。
主要技术方法：研究采集四川万源凤通地区8个蜂场共3个独立批次的GH及高海拔多花蜜（HMH）、低海拔多花蜜（LMH）、油菜蜜（RH），经花粉学分析鉴定蜜源；GH分装后以??Co-γ辐照（4.0、6.0、8.0 kGy）或以旋转蒸发仪50 ℃、100 mbar处理60–80 min至含水量低于20%；样品于37±1 ℃、55%±5%相对湿度加速贮藏0、5、10 d。采用国标GB 14963-2011方法进行微生物计数；提取总微生物基因组DNA，扩增细菌16S rRNA基因V3–V4高变区及真菌ITS1区，于Illumina MiSeq PE300平台测序，经QIIME 2（v.2024）DADA2降噪生成ASVs，分别以SILVA（v.138）与UNITE（v.8）数据库注释；采用30名培训评价员进行感官评价；HS-SPME-GC-MS（DB-5MS柱）与HS-GC-IMS（DB-WAX柱）检测VOCs，以C7–C40正构烷烃及C4–C9正构酮混合标准计算保留指数（RIs），内标半定量并计算相对气味活度值（ROAV）与气味贡献率（OCR）；采用SPSS 26.0进行单因素方差分析（ANOVA）、Duncan检验及非配对t检验（p ≤ 0.05）。
研究结果：
蜜源花粉学鉴定：4月采集样品花粉频率72.71%±2.09%，以Brassica chinensis L.为主要蜜源；8月采集样品优势花粉59.32%±4.47%，鉴定为以Rhus chinensis Mill.为主要蜜源的GH；HMH与LMH花粉多样无优势种，为多源蜜。
新鲜采集蜂蜜的微生物负载：所有新鲜样品均未检出大肠菌群、Salmonella、Shigella、Staphylococcus aureus等常见致病菌；LMH、HMH、RH、GH需氧菌落总数（TPC）为59.68±5.34至160.00±40.00 CFU/g，霉菌36.72±4.38至55.47±6.15 CFU/g，耐渗酵母61.65±7.21至116.67±15.28 CFU/g；GH因采集期气温较高而微生物污染最显著，用于后续辐照杀菌处理（IST）与VCT实验。
γ辐照对GH的去污效率：37 ℃培养10 d后，对照组需氧菌、霉菌、耐渗酵母分别达2,273.33±193.15、373.33±23.63、1,200±103.32 CFU/g，较大贮藏前分别增殖逾14倍、8倍、10倍，并检出大肠菌群6.67±2.89 CFU/g；VCT贮藏后需氧菌与耐渗酵母轻度升至376.67±71.12与196.67±15.28 CFU/g，霉菌增长较快至186.67±18.93 CFU/g；IS6-0与IS8-0中需氧菌、霉菌、耐渗酵母几乎不可检出，IS4-0分别为60、6.67、30 CFU/g；IS4-10需氧菌、霉菌、耐渗酵母增至446.67、210.00、280.00 CFU/g，霉菌与耐渗酵母超出国标限值（≤200 CFU/g），而IS8-10显著较低，分别为83.33、23.33、23.33 CFU/g。结果表明VCT部分抑制需氧菌生长但不足以控制真菌，IST在8 kGy下杀菌效果显著，加速贮藏10 d后仍无显著微生物增殖。
微生物组成变化——细菌群落：稀释曲线达平台且覆盖度达100%，测序深度充分。GH-0中以Bacillota（Firmicutes，55.34%）与Pseudomonadota（44.29%）为主，对应优势属Apilactobacillus（50.85%）与Bombella（39.91%）；GH-10中Bacteroidota升至4.47%，Enterococcus以10.97%成为优势属，其后依次为Methylobacterium（10.38%）、Lactiplantibacillus（7.36%）、Apilactobacillus（4.92%）等，Clostridium、Faecalibacterium等占比不超过2.7%，提示贮藏期间益生菌增殖的同时，Enterococcus、Faecalibacterium、Clostridium、Methylobacterium等属相对丰度升高，发生微生物群落演替。VCT-10中Enterococcus（20.2%）、Clostridium（3.48%）、Faecalibacterium（2.90%）比例高于GH-10而Lactiplantibacillus较低（2.25%），提示VCT部分抑制细菌生长但上述菌属增殖风险仍高，梭菌孢子对脱水处理耐受值得关注。IST（8 kGy）即时使Pseudomonadota降至9.65%、Bacillota升至85.03%，Apilactobacillus（47.26%）与Enterococcus（13.95%）为主要优势属；贮藏后Apilactobacillus与Bombella分别降至0.45%与0.60%，Enterococcus（19.20%）与Lactiplantibacillus（18.16%）占优，提示不同细菌对γ辐照敏感性存在差异。
微生物组成变化——真菌群落：共鉴定5门28种25属。GH-0中以Ascomycota（88.88%）为主，Basidiomycota占7.33%，优势种为Hanseniaspora thailandica（35.40%）、Diutina catenulata（18.12%）、Zygosaccharomyces siamensis（17.50%）等；GH-10优势种变为Z. siamensis（46.64%）、H. thailandica（35.82%）、Zygosaccharomyces mellis（3.73%）、Aspergillus spiculosus（2.91%）等，提示酵母尤其是H. thailandica与Z. siamensis是GH腐败的主要来源。VCT即时提高Ascomycota比例并降低Zygosaccharomyces，H. thailandica（61.60%）与未分类Cladosporium（10.97%）为优势种，贮藏后H. thailandica升至81.85%，成为VCT样品贮藏期主要真菌风险。IST-0（8 kGy）优势种为H. thailandica（64.49%）、Z. siamensis（7.64%）、A. spiculosus（6.26%）等；贮藏后A. spiculosus与Archaeorhizomyces sp.降至1%以下，提示Hanseniaspora较Zygosaccharomyces、Archaeorhizomyces、Aspergillus、Diutina、Filobasidium更耐辐照。综上，新鲜GH含多样真菌，以蜜蜂和花粉来源的Apilactobacillus与Bombella为主要细菌，贮藏期Enterococcus、Faecalibacterium、Clostridium、Methylobacterium及耐渗酵母Hanseniaspora与Zygosaccharomyces等腐败相关类群增殖导致腐败风险，常规脱水VCT无法控制；8 kGy γ辐照杀菌效果显著，几乎抑制所有菌株生长，但Lactiplantibacillus、Enterococcus与Hanseniaspora的较强耐受性仍值得关注。
GH感官品质变化：除RH水白色外，各蜜样均呈琥珀色黏稠外观，甜味顺滑；GH具较强蜂蜜、花香、清凉、果香与甜香（评分>3.0），木质与奶油香较弱（<2.0），无不良风味。贮藏后各样品流体状态无显著变化（>4.0）；IST引起GH色泽变浅，加速贮藏后恢复；VCT与IST均轻度减弱蜂蜜滋味，但嗅觉风味影响不同：VCT即时降低花香、清凉、果香与甜香，IST对GH原有风味无即时影响但产生轻微氧化气味（0.86–0.93），贮藏后该气味消失。结果表明6–8 kGy IST对贮藏后GH感官品质无显著影响，较VCT更好地保留GH特征香气。
GC-MS检测风味物质变化：四种蜂蜜共鉴定60种VOCs，包括4种醇、8种醛、6种酮、14种酯、10种萜烯、16种烃与2种酸；GH因酯类（3.26 μg/g）与酮类（3.12 μg/g）含量高，尤其异佛尔酮（2.66 μg/g）与棕榈酸乙酯（2.19 μg/g）而区别于其他蜜样。ROAV计算显示GH中10种VOCs为重要风味物质（ROAV>1.00），包括苯乙醛（ROAV：100，OCR：58.99%；花香）、十二醛（ROAV：6.10；果香、柑橘、甜）、丁香醛D（ROAV：3.43；花香）三种共有成分，以及异佛尔酮（ROAV：39.93；清凉、薄荷）、苯乙醇（ROAV：1.44；花香、玫瑰）、苯乙酸乙酯（ROAV：4.39；蜂蜜、甜、花香）、十四酸乙酯（ROAV：4.25；蜂蜡、甜、花香）、棕榈酸乙酯（ROAV：3.30；奶油、果香）、(E)-芳樟醇氧化物（呋喃型）（ROAV：1.45；木质、花香）与丁香醛B（ROAV：2.88；花香）七种GH特有成分。GH、VCT/IST组及其贮藏后样品共鉴定61种VOCs；PCA显示PC1与PC2分别为53.85%与22.09%，IST样品与对照分离程度小于VCT，IS6与IS8组贮藏前后统计不可区分，提示6与8 kGy IST对GH VOCs影响不显著，VCT对VOCs组成影响更大。加速贮藏（GH-10）引起酯类、脂肪酸与烃类下降、醇类升高，6-氧代庚酸由0.52 μg/g累积逾3倍至1.91 μg/g；醇类升高源于苯乙醇（至0.37 μg/g）等，对香气正向作用甚微，而棕榈酸乙酯由2.19降至1.77 μg/g致奶油香减弱，2-辛基环丙烯-1-庚醇生成与亚油酸下降对应。VCT即时损失异佛尔酮（降至1.40 μg/g）、棕榈酸乙酯、苯乙醇、环氧芳樟醇、(E)-芳樟醇氧化物（呋喃型）等GH特有风味成分，致花香、木质、奶油尤其清凉香减弱，贮藏期果香、木质与奶油香可因棕榈酸乙酯回升及醛酯累积而部分补偿，但VCT样品贮藏后具不良气味的VOCs含量最高，包括6-氧代庚酸（2.44 μg/g）、2-辛基环丙烯-1-庚醇（0.25 μg/g）与2,6-二甲基-2,7-辛二烯-1,6-二醇（0.65 μg/g），提示VCT致高挥发性风味物质在减压过程中逸散，并可能因持续加热与微生物控制不力产生脂肪酸氧化及酶促转化相关VOCs。γ辐照则保留GH特征风味物质浓度，贮藏后苯乙醇、异佛尔酮与(E)-芳樟醇氧化物（呋喃型）仍较高，维持花香、木质与清凉香；IS8贮藏后不良VOCs含量最低，6-氧代庚酸1.43–1.69 μg/g、2-辛基环丙烯-1-庚醇0.14–0.19 μg/g、2,6-二甲基-2,7-辛二烯-1,6-二醇为0 μg/g，提示γ辐照可能灭活特定生物转化所需的微生物或酶；但8 kGy即时诱导(9Z)-9,17-十八碳二烯醛、异佛尔酮氧化物、2-(1-甲基-2-氧丙基)-环己酮、3-苯基丙酸乙酯与二十烷生成并使环氧芳樟醇消失，贮藏后出现2-十一酮、优葛缕酮、磷酸三乙酯、甲酸庚酯、邻苯二甲酸二异丁酯、亚油酸甲酯等，提示γ辐照在保护原有风味、防止不良气味的同时可能启动脂质过氧化与美拉德相关途径并诱导特定化学结构裂解重排。
HS-GC-IMS检测VOCs：共检测69种VOCs，55种经数据库比对确证，考虑电离过程中单体与二聚体形式后保留40种化合物，包括11种醇、7种醛、9种酮、6种酯、2种萜烯、1种酸、3种呋喃与1种含硫化合物。ROAV>1的7种化合物为GH关键风味贡献者：1-己醇（ROAV：1.78；果香、叶香、木质）、3-甲基-1-丁醇（ROAV：1.81；果香、苹果）、(E,E)-2,4-辛二烯醛（ROAV：15.93；果香、梨）、1-壬醛（ROAV：7.41；花香、果香、柑橘）、庚醛（ROAV：4.83；果香、辛辣）、3-羟基-2-丁酮（ROAV：1.98；奶油）与异戊酸乙酯（ROAV：100；果香、苹果），补充了GC-MS所鉴定的GH特征VOCs，尤以果香与奶油香为主。GC-IMS PCA的PC1与PC2合计70.79%，IST组较VCT组更接近GH，提示IST对VOCs修饰相对温和，与GC-MS结果一致。贮藏引起VOCs总体升高，乙酸、醇类（3-甲基-1-丁醇、1-丁醇、2-甲基-1-丙醇、乙醇）、酯类（丁二酸二乙酯、乳酸乙酯、异戊酸乙酯、乙酸乙酯）及二烯丙基硫醚（由0.20升至0.36 μg/g）升高，反映微生物醇代谢、酯化及含硫前体降解；2-糠醛、2-乙酰基呋喃、(E,E)-2,4-辛二烯醛、苯甲醛等检出提示GH新鲜度下降。VCT-0 VOCs总量最低，GH原有醇、酮、酯普遍下降，而乙酸、2,5-二甲基-4-甲氧基-3[2H]-呋喃酮等升高，提示VCT可能加速美拉德与发酵相关反应；贮藏期VCT减缓酯类累积，但1-羟基-2-丙酮、2-糠醛、苯甲醛与(E,E)-2,4-辛二烯醛显著升高，提示VCT未中止贮藏期微生物活动与生化反应，并直接消耗GH特有VOCs。IST样品VOCs最丰富，8 kGy即时使乙酸乙酯、异戊酸乙酯等酯类及2-丁酮、2-丙酮、1-羟基-2-丙酮等酮类升高，GH原有风味物质损失最小；二烯丙基硫醚与乙酸含量较低归因于8 kGy杀菌作用；但IST诱导(E,E)-2,4-己二烯醛（草莓4 kGy ??Co-γ辐照特有产物）急剧升高，苯甲醛、2-糠醛与2-乙酰基呋喃显著升高，提示IST可能对美拉德相关途径VOCs具延迟促进作用，惟其贡献度低对GH风味无显著影响。
基于多组学的相关性分析：VCT样品中，6-氧代庚酸与Enterobacteriaceae、Saccharomyces sp.、Bionectria solani、Microdochium bolleyi正相关（>0.9），2-辛基环丙烯-1-庚醇与2,6-二甲基-2,7-辛二烯-1,6-二醇与Segatella、Enterobacteriaceae等正相关（>0.9），乙酸与Weissella及未分类Nectriaceae正相关（>0.9），提示微生物活动对不良VOC累积的潜在作用；异佛尔酮、苯乙醇、棕榈酸乙酯、(E)-芳樟醇氧化物（呋喃型）等GH特征风味成分与特定微生物显著负相关（0.9），提示γ辐照未完全消除微生物–VOC关联，但关联更具选择性且不强烈涉及主要保留的GH特征香气成分。因此，与VCT相比，8 kGy γ辐照似能更好地保持GH特征香气轮廓，同时减少与香气劣变相关的广泛微生物耦合。
讨论与结论：本研究证实地理标志农产品GH以苯乙醛、异佛尔酮、苯乙醇、十二醛、丁香醛及酯类为主要风味物质，具特征性强烈清凉感，以Apilactobacillus与Bombella为主要益生菌。γ辐照（8 kGy）而非单纯真空浓缩水分控制，被证实可有效抑制Enterococcus、Methylobacterium、Clostridium、Faecalibacterium及耐渗酵母等潜在不良类群的增殖，同时维持GH特征香气物质；γ辐照抑制了若干可能与微生物或酶促转化相关的不良VOCs，尽管氧化与美拉德相关途径VOCs水平有所升高。因此，γ辐照被认为是蜂蜜及含蜂蜜食品杀菌的有效且有前景的非热策略，对贮藏后感官品质无显著损害。
