STAT1–IRF1–ACSL4轴通过脂质过氧化依赖性机制驱动腹膜纤维化与铁死亡

《Renal Failure》：The STAT1–IRF1–ACSL4 axis drives peritoneal fibrosis and ferroptosis via lipid peroxidation-dependent mechanisms

　　

腹膜纤维化是长期腹膜透析的主要并发症，由转化生长因子-β1（TGF-β1）介导的间皮细胞功能障碍驱动。新出现的证据将铁死亡（一种依赖脂质过氧化的细胞死亡形式）与纤维化疾病联系起来，但腹膜病理中的分子机制仍不清楚。在此，研究人员探讨了STAT1–IRF1–ACSL4轴在人腹膜间皮细胞（HPMCs）中TGF-β1诱导的纤维化和铁死亡中的作用。研究人员用TGF-β1刺激HPMCs建立体外纤维化模型，并进行ACSL4敲低、ACSL4过表达或用Ferrostatin-1抑制铁死亡。TGF-β1显著上调纤维化标志物（α-SMA、Collagen I）、铁死亡相关蛋白（MDA、4-HNE、PTGS2）以及STAT1–IRF1信号通路，同时抑制抗氧化系统（GPX4、SLC7A11）（P?<?0.001）。ACSL4敲低显著恢复细胞活力，减少脂质过氧化、Fe2+积累、铁死亡激活和炎症细胞因子分泌（IL-1β、IL-18）（P?<?0.001）。相反，ACSL4过表达加剧了TGF-β1诱导的铁死亡、纤维化和炎症。从机制上讲，ACSL4调控STAT1–IRF1轴的激活，这可通过STAT1磷酸化和IRF1核转位的变化得以证实。值得注意的是，Ferrostatin-1逆转了ACSL4诱导的脂质过氧化，抑制了STAT1–IRF1激活，恢复了GPX4表达，并减弱了纤维化和炎症反应（P?<?0.01）。综上所述，这些发现表明STAT1–IRF1–ACSL4轴在腹膜间皮细胞中将依赖于脂质过氧化的铁死亡与促纤维化和促炎信号整合在一起，从而确定以ACSL4为中心的铁死亡信号作为腹膜纤维化的潜在治疗靶点。

研究背景与科学问题

腹膜透析（PD）是终末期肾病患者的重要肾脏替代疗法，但其长期疗效常因腹膜纤维化而受损。腹膜纤维化是一种以细胞外基质（ECM）沉积、间皮细胞丢失和慢性炎症为特征的进行性病理过程，最终导致腹膜超滤衰竭和透析终止。尽管对纤维化机制的理解不断深入，但治疗策略仍然有限，亟需寻找新的分子靶点。近年来，酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）因其在脂质过氧化和细胞命运决定中的关键作用而受到关注。ACSL4催化长链脂肪酸与辅酶A结合，优先富集膜磷脂中的多不饱和脂肪酸（PUFAs），从而为脂质过氧化和铁死亡提供底物。铁死亡是一种铁依赖性的、由氧化性脂质损伤驱动的调节性细胞死亡形式。已有研究表明，ACSL4在肾脏、肺脏和肝脏等多种器官的纤维化中发挥核心作用，但其在腹膜纤维化中的角色尚不明确。转化生长因子-β1（TGF-β1）是纤维化的主调控因子，可驱动人腹膜间皮细胞（HPMCs）的肌成纤维细胞分化和ECM产生。近期研究提示TGF-β1也能调节铁代谢和氧化还原稳态，可能将纤维化与铁死亡联系起来。干扰素调节因子1（IRF1）是ACSL4的转录调控因子，而IRF1本身又由信号转导及转录激活因子1（STAT1）激活。这一STAT1–IRF1–ACSL4轴已在放射性肠损伤中被证实，但在腹膜病理中尚未被探索。因此，本研究旨在探讨TGF-β1是否通过激活STAT1–IRF1–ACSL4轴来驱动腹膜纤维化和铁死亡，并评估ACSL4作为潜在治疗靶点的价值。

主要技术方法

研究人员采用体外培养的人腹膜间皮细胞（HPMCs，购自武汉普诺赛生命科技有限公司），使用重组人TGF-β1处理48小时建立纤维化模型。通过特异性小干扰RNA（siRNA）实现ACSL4基因敲低，通过pcDNA3.1载体构建ACSL4过表达质粒进行基因过表达，并使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1进行干预。研究中运用了以下关键技术：细胞活力检测采用CCK-8法；基因表达分析采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）；蛋白表达水平检测采用蛋白质印迹法（Western blot）；脂质过氧化水平评估采用BODIPY荧光染色；细胞内Fe²⁺含量测定采用流式细胞术；蛋白亚细胞定位及共定位分析采用免疫荧光（IF）染色；炎症细胞因子IL-1β和IL-18分泌量检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA）。

研究结果

3.1 ACSL4调节铁死亡和纤维化相关蛋白的表达

通过Western blot和qRT-PCR验证转染效率后，研究发现TGF-β1处理显著上调纤维化标志物（α-SMA、Collagen I）和铁死亡相关蛋白（GPX4、SLC7A11）的表达。ACSL4敲低显著降低这些促纤维化和铁死亡相关蛋白/基因的表达，而ACSL4过表达则加剧TGF-β1诱导的纤维化和铁死亡标志物变化。Ferrostatin-1共处理可逆转ACSL4过表达的效果，减弱纤维化和铁死亡标志物，表明铁死亡在ACSL4介导的纤维化中发挥关键作用。

3.2 抑制ACSL4或铁死亡减轻TGF-β1诱导的脂质过氧化和Fe²⁺积累

TGF-β1处理显著降低HPMCs细胞活力，增加脂质过氧化标志物（MDA、4-HNE、PTGS2）的表达，增强BODIPY荧光强度，并提高细胞内Fe²⁺水平。ACSL4敲低显著恢复细胞活力，降低脂质过氧化和Fe²⁺积累。ACSL4过表达则进一步加重细胞损伤和脂质过氧化。Ferrostatin-1共处理显著改善细胞存活率，减弱脂质过氧化和Fe²⁺积累，证实铁死亡是ACSL4介导细胞功能障碍的关键机制。

3.3 ACSL4通过激活STAT1–IRF1信号轴调节铁死亡

TGF-β1处理显著上调STAT1和IRF1的mRNA和蛋白水平，增强STAT1磷酸化和IRF1核转位。ACSL4敲低降低了STAT1、p-STAT1和IRF1水平，削弱STAT1–IRF1轴的激活。ACSL4过表达则显著提高这些蛋白的表达并促进IRF1核转位。Ferrostatin-1共处理可降低STAT1、p-STAT1和IRF1表达并阻断IRF1核转位，提示铁死亡介导了ACSL4诱导的STAT1–IRF1通路激活。

3.4 ACSL4通过与α-SMA和GPX4的共定位促进纤维化和铁死亡，并驱动促炎细胞因子分泌

免疫荧光染色显示，TGF-β1处理后ACSL4与α-SMA在细胞质中呈现强共定位，同时GPX4表达受抑。ACSL4敲低恢复了GPX4分布至接近对照水平。ACSL4过表达增强了ACSL4与α-SMA的共定位，与纤维化加重相一致。Ferrostatin-1共处理部分逆转了ACSL4过表达并恢复了GPX4表达。ELISA结果显示，TGF-β1显著增加IL-1β和IL-18分泌，ACSL4敲低抑制了这两种细胞因子的释放，而ACSL4过表达进一步升高其水平，Ferrostatin-1共处理则显著降低炎症因子分泌。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究首次揭示了STAT1–IRF1–ACSL4轴在腹膜纤维化中的作用，填补了铁死亡与腹膜病理之间的空白。研究证实ACSL4是连接脂质过氧化、炎症反应和纤维化重塑的核心介质。ACSL4驱动的脂质过氧化破坏了氧化还原稳态，而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1的部分挽救效果提示非铁死亡途径（如经典TGF-β/Smad信号）也可能协同参与纤维化发生。研究还确认了STAT1和IRF1作为ACSL4上游调控因子的作用，但未直接证明IRF1对ACSL4启动子的转录调控，脂质过氧化与STAT1–IRF1信号之间的反馈环路也仍需进一步阐明。此外，升高的IL-1β和IL-18提示NLRP3炎症小体可能被ACSL4驱动的铁死亡所激活。研究的局限性包括：仅依赖体外细胞模型缺乏体内验证；TGF-β1激活STAT1–IRF1的具体机制不清；未通过siRNA敲低STAT1或IRF1来建立因果联系；未探索其他铁死亡调控因子如FSP1或DHODH的作用；缺乏临床样本数据。未来研究应整合动物模型和临床样本，利用ChIP-seq和激酶活性测定等阐明机制，并测试ACSL4抑制剂与现有抗纤维化药物的联合治疗效果。

研究结论翻译：总之，本研究证明STAT1–IRF1–ACSL4信号轴是通过依赖脂质过氧化的铁死亡机制驱动TGF-β1诱导的腹膜纤维化的关键分子驱动因素。ACSL4的失调激活促进了腹膜间皮细胞的铁死亡、炎症放大和纤维化重塑，而抑制ACSL4活性或药理学抑制铁死亡可有效减弱这些致病过程。这些发现确立了以ACSL4为中心的铁死亡信号作为氧化应激、炎症和腹膜纤维化之间的关键机制联系，并强调STAT1–IRF1–ACSL4轴作为预防和治疗PD相关纤维化的有前景的治疗靶点。未来的体内研究有必要进一步验证靶向该通路的转化潜力。