NADPH氧化酶相关氧化应激与铁死亡相关损伤在草酸钙暴露的肾小管上皮细胞中的作用：PI3K/AKT参与的药理学证据

《Renal Failure》：NADPH oxidase–associated oxidative stress and ferroptosis-related injury in calcium oxalate-exposed renal tubular epithelial cells: pharmacological evidence for PI3K/AKT involvement

　　

背景/目的：草酸钙（CaOx）晶体在肾结石病中参与肾小管损伤，但NADPH氧化酶（NOX）、氧化应激、铁死亡相关损伤与PI3K/AKT信号通路之间的关系尚未完全阐明。研究人员在NRK-52E肾小管上皮细胞中检测了CaOx诱导的损伤，并测试了药理学NOX和PI3K抑制对氧化应激和铁死亡相关读数的影响。 方法：将NRK-52E细胞暴露于CaOx（0–10 mM），并通过CCK-8、DCFH-DA流式细胞术、NOX活性测定、NADPH和Fe2+测定、GSH和丙二醛（MDA）测定、定量实时PCR（qRT-PCR）、Western blotting和转录组测序进行评估。Ferrostatin-1（Fer-1，2 μM）、Erastin（10 μM）、NOX抑制剂GKT137831（10 μM）和PI3K抑制剂LY294002（10 μM）被用作药理学探针。 结果：CaOx以浓度依赖性方式降低细胞活力并增加细胞内活性氧（ROS）。在1 mM浓度下，CaOx与较低的NADPH和GSH、较高的Fe2+、MDA和ROS、增加的NOX活性和NOX4 mRNA及蛋白表达、降低的GPX4以及增加的ACSL4相关。Fer-1改善了而Erastin加重了若干铁死亡相关读数。CaOx还增加了p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值。GKT137831和LY294002各自在该细胞模型中减弱了CaOx相关的氧化应激和铁死亡相关表型。 结论：研究结果支持NOX相关氧化应激和铁死亡相关损伤对CaOx暴露的NRK-52E细胞有贡献。药理学实验表明NOX和PI3K/AKT信号通路参与该表型。这些发现仅限于体外细胞模型，需要在动物和人类相关系统中进行验证。

一、研究背景与问题

肾结石病在西方国家影响约7%–13%的人群，在亚洲影响5%–9%的人群，其中草酸钙（CaOx）是约80%肾结石的主要成分。当CaOx晶体沉积于肾小管上皮细胞后，会破坏细胞内氧化还原稳态、激发炎症信号并损伤上皮，受损细胞为晶体滞留提供更有利的表面，进而促进聚集和钙化。活性氧（ROS）在此过程中发挥核心作用，临床和实验研究均显示肾结石病中尿液和肾组织ROS水平升高，且ROS积累越严重伴随的肾小管损伤越重。CaOx晶体还可通过ROS依赖性途径激活NLRP3炎症小体，加剧肾脏炎症。然而，NOX来源的氧化应激对CaOx诱导的肾小管上皮损伤的贡献尚未完全明确。

NADPH氧化酶（NOX）是肾小管上皮细胞中超氧阴离子的酶学来源，既往研究提示NOX来源的氧化应激参与肾损伤，但其对CaOx暴露的肾小管细胞的贡献需要直接实验检验。由于NOX来源的ROS可促进脂质过氧化，铁死亡（ferroptosis）可能是下游损伤反应的合理组成部分。铁死亡是一种铁依赖性的调节性细胞死亡形式，由脂质过氧化和GPX4活性丧失驱动，在机制上区别于凋亡和坏死。在肾脏中，铁死亡与急性肾损伤、顺铂肾毒性和糖尿病肾病中的肾小管损伤相关。高草酸盐水平可激活肾小管细胞中的铁死亡相关通路，Ferrostatin-1（Fer-1）可在体外减轻草酸盐诱导的细胞死亡和晶体沉积。然而，NOX相关氧化应激与CaOx暴露后铁死亡相关变化之间的关系仍未完全阐明。PI3K/AKT信号通路以环境依赖方式调节细胞存活、氧化还原稳态和铁死亡相关过程，其在CaOx相关肾小管损伤中的功能方向仍不确定。

二、研究内容与结论

研究人员使用NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞，结合药理学调控、qRT-PCR、转录组测序和蛋白水平分析，系统考察了CaOx诱导的损伤、氧化应激、铁死亡相关读数及PI3K/AKT信号通路。研究发现CaOx暴露伴随ROS升高、NOX活性增加、NOX4 mRNA和蛋白表达上调、MDA升高、GPX4降低和ACSL4升高，支持NOX相关氧化还原紊乱与铁死亡相关损伤之间的关联。药理学实验表明NOX抑制剂GKT137831和PI3K抑制剂LY294002均可减轻CaOx相关的氧化应激和铁死亡相关表型，提示NOX和PI3K/AKT信号通路参与该损伤表型。这些发现为理解肾结石病中肾小管损伤的分子机制提供了体外药理学证据，并为后续在动物模型和人类相关系统中的验证奠定了基础。

三、主要关键技术方法

研究人员采用以下关键技术方法：使用NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞系作为体外模型；CCK-8法检测细胞活力；DCFH-DA荧光探针结合流式细胞术检测细胞内ROS；NOX活性测定试剂盒检测NOX酶活性；NADPH含量测定、细胞内Fe²⁺含量测定、GSH和MDA生化检测评估氧化还原状态和脂质过氧化；Western blot检测NOX4、GPX4、ACSL4、OPN、MCP-1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT等蛋白表达及磷酸化水平；qRT-PCR检测NOX4 mRNA表达；mRNA转录组测序（Illumina PE150，每组3个独立生物学重复）结合DESeq2差异表达分析、GO和KEGG通路富集分析。药理学探针包括Fer-1（2 μM）、Erastin（10 μM）、GKT137831（10 μM）和LY294002（10 μM）。

四、研究结果

1. 1.
   CaOx降低NRK-52E细胞活力、增加ROS并升高NOX相关读数

将NRK-52E细胞暴露于0、0.1、0.5、1、5或10 mM CaOx，细胞活力随CaOx浓度升高而降低，细胞内ROS随浓度升高而增加，呈现浓度依赖性损伤特征。基于此选择1 mM CaOx进行后续实验。在1 mM CaOx下，NOX活性增加，NOX4 mRNA和蛋白表达升高，ACSL4表达增加而GPX4表达降低，提示NOX相关氧化应激与铁死亡相关分子变化之间存在关联。

1. 2.
   Fer-1和Erastin药理学调节CaOx暴露细胞的铁死亡相关读数

将细胞分为Blank、CaOx、CaOx+Fer-1（2 μM）和CaOx+Erastin（10 μM）组。与Blank相比，CaOx单独处理降低NADPH含量、增加Fe²⁺和ROS、降低细胞活力。Fer-1逆转而Erastin加重了这些读数中的若干项，产生相反的药理学效应，支持CaOx诱导损伤中存在铁死亡相关成分。

1. 3.
   CaOx改变铁死亡相关和炎症相关蛋白

Western blot显示CaOx降低GPX4并增加ACSL4，Fer-1部分逆转而Erastin强化这些变化。OPN和MCP-1在CaOx暴露后增加，Fer-1减弱而Erastin强化这些变化。炎症介质表达与铁死亡相关读数共变，提示氧化损伤、铁死亡相关变化与炎症信号之间存在关联。

1. 4.
   转录组分析鉴定氧化还原、铁死亡和PI3K/AKT相关通路

以|log₂FC|>1和FDR<0.05为标准，鉴定出153个差异表达基因（135个上调、18个下调）。GO分析显示差异基因与生物调控、代谢过程、刺激反应、结合和催化活性相关，氧化还原相关过程在GO富集中突出。KEGG分析显示差异基因映射至泛素介导的蛋白水解、核糖体相关通路、铁死亡、线粒体自噬、HIF-1信号和PI3K-AKT信号等通路类别。

1. 5.
   CaOx增加PI3K和AKT磷酸化

Western blot显示CaOx暴露细胞中p-PI3K（Tyr607）和p-AKT（Ser473）升高，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值相对Blank增加，CaOx暴露伴随PI3K/AKT磷酸化增加，与NOX上调和铁死亡相关变化平行。

1. 6.
   药理学NOX抑制减轻CaOx相关氧化应激和铁死亡相关变化

GKT137831（10 μM）预处理1小时并与CaOx（1 mM）共暴露24小时。GKT137831共处理改善了CaOx诱导的细胞活力降低，减弱了细胞内ROS积累，显著降低了CaOx诱导的NOX活性增加，恢复了GSH水平并减弱了MDA含量增加。Western blot显示GKT137831部分逆转了CaOx诱导的ACSL4增加和GPX4降低。

1. 7.
   PI3K抑制减轻CaOx相关氧化应激和铁死亡相关变化

LY294002（10 μM）预处理1小时并与CaOx（1 mM）共暴露24小时。LY294002共处理改善了CaOx诱导的细胞活力降低，减弱了ROS积累，部分恢复了GSH水平并降低MDA积累。Western blot显示LY294002减弱了CaOx相关的ACSL4增加并部分恢复GPX4表达，同时降低了CaOx处理细胞中的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值。

五、讨论与结论

讨论部分指出，CaOx暴露伴随Fe²⁺积累、NADPH耗竭、ROS升高和活力降低，这些读数被Fer-1和Erastin以相反方向调节，结合GPX4降低和ACSL4增加，支持损伤中存在铁死亡相关成分。但研究人员强调不能从Fer-1/Erastin实验推断铁死亡是CaOx诱导细胞死亡的唯一或主导模式，需要与凋亡和坏死性凋亡干预及读数进行直接比较。NADPH耗竭仅被解释为氧化还原/代谢变化，NOX参与的直接证据来自NOX活性测定、NOX4表达和GKT137831药理学抑制。CaOx增加OPN和MCP-1表达且被Fer-1和Erastin调节，提示氧化损伤、铁死亡相关变化与炎症信号之间的关联，但不证明铁死亡是OPN/MCP-1诱导的上游原因。PI3K/AKT信号在CaOx相关损伤中的功能角色具有背景依赖性，既往研究既有细胞保护性报道也有损伤相关性报道。在本NRK-52E模型中，CaOx增加p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值，LY294002减弱多种氧化应激和铁死亡相关读数，药理学证据支持PI3K/AKT信号在本实验条件下具有损伤相关功能方向，但不确立其与NOX的上下游层级关系。

研究结论：草酸钙暴露于NRK-52E细胞与NOX活性和NOX4 mRNA及蛋白表达增加、ROS积累、GSH和NADPH降低、Fe²⁺和MDA增加、GPX4降低及ACSL4增加相关。Fer-1/Erastin和GKT137831/LY294002实验支持铁死亡相关过程、NOX和PI3K/AKT信号通路的药理学参与。这些体外数据不建立完整的因果通路，不排除其他调节性细胞死亡程序，也不证明与动物或人类肾结石病的相关性。