《Renal Failure》：Association of non-methane volatile organic compound emission burden with chronic kidney disease: integrated epidemiological, transcriptomic and in vitro analyses
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背景：环境暴露于非甲烷挥发性有机物（NMVOCs）可能促进慢性肾脏病（CKD）的发生，但其潜在分子通路尚不清楚。研究人员整合了流行病学、转录组学、单细胞及实验分析，以识别将NMVOCs与肾损伤联系起来的候选机制。方法：研究人员将省级NMVOC排放负担与中国健康
背景：环境暴露于非甲烷挥发性有机物（NMVOCs）可能促进慢性肾脏病（CKD）的发生，但其潜在分子通路尚不清楚。研究人员整合了流行病学、转录组学、单细胞及实验分析，以识别将NMVOCs与肾损伤联系起来的候选机制。方法：研究人员将省级NMVOC排放负担与中国健康与养老追踪调查（CHARLS）中3,472名参与者的居住省份进行关联。CKD定义为估算肾小球滤过率（eGFR）<60 mL/min/1.73 m2。采用多因素逻辑回归评估关联性。研究人员利用推定的NMVOC-CKD靶点、肾脏转录组数据集、113种机器学习模型及SHapley加法解释（SHAP）对生物标志物进行优先级排序。采用单细胞转录组学、细胞通讯分析、虚拟敲除及氢醌处理的细胞实验探究候选通路。结果：在3,472名参与者中，417例患有CKD。在完全校正模型中，较高的省级NMVOC排放负担与较高的CKD患病几率相关（OR = 1.05）。最佳转录组分类器在训练集和验证集中的曲线下面积分别为0.964和0.836。整合分析将SLC9A3列为优先候选基因，并将其表达定位于近端小管细胞。单细胞分析预测近端小管细胞与成纤维细胞之间存在SPP1-ITGAV/ITGB1信号传导。在苯代谢物模型中，氢醌增加了小管SLC9A3和SPP1的表达；条件培养基增加了成纤维细胞ITGB1和α-平滑肌肌动蛋白的表达及迁移。结论：省级NMVOC排放负担与CKD相关。研究结果提名近端小管SLC9A3/SPP1-整合素信号传导作为NMVOC排放负担与成纤维细胞活化之间的候选联系，值得通过个体水平暴露评估和靶向扰动研究加以验证。
慢性肾脏病（CKD）是全球性非传染性公共卫生问题，其发病率和死亡率在过去数十年持续上升。传统上，CKD主要被视为糖尿病和高血压等代谢及血流动力学紊乱所致的器官损伤。然而，随着流行病学研究的推进，仅基于代谢和生活方式因素的疾病模型已不足以完全解释CKD的复杂全球负担。在环境暴露领域，既往研究多聚焦于重金属和细颗粒物。随着全球工业化和城市化进程，非甲烷挥发性有机物（NMVOCs）逐渐成为环境肾脏病学的新前沿。NMVOCs指除甲烷外、具有高蒸气压且在室温下易挥发的有机碳化合物，其排放来源极为广泛，涉及化石燃料燃烧、工业生产、建筑材料和日用消费品等。NMVOCs可通过吸入、皮肤接触或消化道进入体循环，经肝脏细胞色素P450酶系统代谢后，其高活性代谢物通过干扰线粒体电子传递链或激活NADPH氧化酶诱导活性氧（ROS）过度产生，从而触发氧化应激和脂质过氧化。肾近端小管上皮细胞高表达多种溶质载体（SLC）转运体，NMVOC代谢物经此进入并在小管上皮细胞局部蓄积，进而诱导线粒体损伤、细胞凋亡和间质纤维化。既往人群研究表明，NMVOC排放负担与慢性肾功能下降显著相关。为填补流行病学观察与分子毒理学机制之间的知识空白，本研究整合了流行病学暴露评估、网络毒理学、公共批量及单细胞转录组分析和体外实验，旨在探究肾脏微环境对环境毒物反应的异质性，并为环境毒物所致肾损伤的早期干预提供科学依据和潜在靶点。
研究人员开展了以下研究：基于CHARLS队列2015年波次数据进行横断面分析，纳入具有完整居住省份信息、明确CKD结局状态和完整协变量数据的参与者，最终纳入3,472名参与者。省级NMVOC排放数据来自中国多分辨率排放清单（MEIC），每位参与者被赋予其记录居住省份对应的排放值。采用多因素逻辑回归评估省级NMVOC排放代理指标与CKD患病几率之间的关联，构建三个逐步校正模型。在敏感性分析中，将参与者分为G1（≥90）、G2（60–89）或G3+（<60 mL/min/1.73 m
2）进行多项逻辑回归，并以G1为参照。此外，基于肥胖、血脂异常、吸烟和饮酒状态进行分层亚组分析。通过CTD、TargNet和SwissTargetPrediction数据库筛选NMVOC主要成分（甲醛、苯、异戊二烯和三氯乙烯）的潜在靶点，同时利用OMIM和GeneCards检索CKD相关基因，取交集获得165个共同靶基因，并进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。将重叠基因提交至STRING数据库获取蛋白质相互作用（PPI）数据，导入Cytoscape软件可视化并计算网络拓扑属性，按度值排序识别前10个枢纽基因，构建化合物-靶点-疾病的综合调控网络。从GEO数据库获取独立转录组数据集GSE37171（训练集）和GSE66494（验证集），在训练集中构建并评估113种机器学习算法组合，基于受试者工作特征曲线下面积（AUC）评分选择最佳诊断模型，并采用SHAP方法分析模型可解释性，通过计算平均绝对SHAP值衡量特征基因贡献以确定核心诊断标志物。获取正常对照和CKD样本的单细胞转录组数据（GSE199711，含2例正常肾脏细胞样本和3例CKD肾脏细胞样本），使用Seurat R包进行数据质控、标准化、降维和非线性聚类，利用SingleR规范标志物注释细胞类型，使用CellChat R包构建微环境全局细胞通讯网络，精确定位损伤细胞（发送者）与间质细胞（接收者）之间的关键受体-配体互作轴。最后，采用单细胞虚拟敲除算法scTenifoldKN模拟关键基因功能缺失，评估下游重吸收受体和损伤标志物的代偿性表达变化。体外实验选用大鼠肾小管上皮NRK-52E细胞和大鼠肾间质成纤维NRK-49F细胞，以氢醌（HQ；苯的生物活性氧化代谢物）作为概念验证模型代谢物，NRK-52E细胞经0、10或20 μmol/L HQ处理24 h后移除含HQ培养基并洗涤，更换新鲜无HQ完全培养基继续培养24 h后收集条件培养基。NRK-49F细胞分为六组：仅含10% FBS的新鲜培养基（FBS-Only）、对照条件培养基（CM-Control）、CM-HQ10、CM-HQ20、含10 μmol/L HQ的新鲜培养基（Direct-HQ10）和含20 μmol/L HQ的新鲜培养基（Direct-HQ20）。采用CCK-8法评估HQ对NRK-52E细胞的细胞毒性，采用qRT-PCR检测SLC9A3和SPP1 mRNA表达，采用Western blotting检测SLC9A3、SPP1、ITGB1和α-SMA蛋白表达，采用Transwell实验评估成纤维细胞定向迁移能力。
研究结果显示：在3,472名参与者中，417例患有CKD。CKD疾病负担呈现明显的地域差异。基线分析显示，CKD组女性比例更高、受教育程度较低，且区域NMVOC排放负担显著升高；此外，CKD组心血管和代谢特征更差，肥胖和血脂异常比例更高，BMI、血脂、血压和C反应蛋白（CRP）水平升高（p < 0.05）。多因素逻辑回归显示，较高的省级NMVOC排放负担与较高的CKD患病几率相关，在完全校正模型中OR = 1.05（95% CI：1.03–1.08）。在探索性亚组分析中，该关联在肥胖参与者中可观察到；在伴和不伴血脂异常的参与者中该显著关联持续存在；吸烟和饮酒状态未改变该相关性。在完全校正模型中，较高的省级NMVOC排放负担与G2和G3+相对于G1的更高几率相关。
在靶点鉴定方面，通过交集分析共鉴定出165个NMVOCs与CKD共享的靶基因。GO聚类分析显示，这些靶点主要富集于对氧水平的反应和缺氧反应，主要定位于膜微区、膜筏和小窝；分子功能层面主要涉及蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性。KEGG通路富集分析表明，交集基因高度富集于细胞凋亡、脂质与动脉粥样硬化、PI3K-Akt信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路和MAPK信号通路。通过Cytoscape构建化合物-靶点-疾病综合调控网络，按度值排序前10个关键枢纽基因依次为SLC9A3、MAPK1、SIRT1、PTGS2、CYP19A1、ESR1、TNF、MAOA、APP和CDKN1A。
在机器学习诊断模型构建方面，基于整体AUC评分对所有模型进行评估和排序，结果显示Stepglm[both] + Lasso算法组合表现最佳，其在训练集中的AUC达到0.964，在外部验证集中的AUC达到0.836，综合评分最高（AUC = 0.900）。应用SHAP方法分析特征重要性，基于平均绝对SHAP值排序，前几位候选特征基因为CLK4（0.276）、CDC25B（0.184）、SLC9A3（0.111）、METAP2（0.089）、FDPS（0.022）和APP（0.014）。单基因ROC曲线验证表明，CLK4的AUC表现最为突出（AUC = 0.870），METAP2、SLC9A3和FDPS的AUC分别达到0.791、0.754和0.735。在两个独立CKD转录组数据集中验证五个机器学习识别的核心基因，结果显示SLC9A3显著上调，CLK4和CDC25B下调，结果一致；METAP2和FDPS表达趋势不一致。
在单细胞分析方面，通过UMAP非线性降维聚类识别出10个主要细胞亚群。特征分布图显示SLC9A3在近端小管中特异性高表达且在CKD中显著上调。CellChat分析鉴定SPP1为突出的推断信号通路。配体-受体分析进一步预测近端小管细胞至成纤维细胞的SPP1-ITGAV/ITGB1信号传导。虚拟敲除模拟预测模拟SLC9A3缺失后受体表达改变，其中ITGB1显示最强的预测代偿性增加（Z-score = 6.24）。其他检测受体的预测变化较小，方向性分析表明预测通路活动呈现一致模式。
体外实验验证方面，10或20 μmol/L HQ处理在96 h观察期内未显著改变NRK-52E细胞活力。暴露24 h后，两种HQ浓度均较未处理对照显著增加SLC9A3和SPP1 mRNA表达。Western blotting显示SLC9A3和SPP1蛋白表达相应增加，以20 μmol/L HQ处理后水平最高。HQ移除和洗涤后收集的条件培养基增加了NRK-49F细胞中成纤维细胞活化标志物表达。与FBS-Only和CM-Control组相比，CM-HQ10和CM-HQ20显著增加ITGB1和α-SMA蛋白表达，CM-HQ20组反应更强。FBS-Only与CM-Control组间无显著差异。直接暴露于10或20 μmol/L HQ未能重现条件培养基诱导的增加。与蛋白表达结果一致，CM-HQ10和CM-HQ20显著增加NRK-49F迁移，CM-HQ20组迁移细胞数最多。
讨论部分指出，CKD是全球公共卫生的重大挑战，长期以来关于CKD病因的讨论主要集中于糖尿病、高血压、自身免疫异常和遗传变异等传统危险因素。最新环境健康评估模型表明，在高风险人群中，高达26%的肾脏疾病发生风险可能与复杂环境毒素暴露直接相关。在环境污染的庞大矩阵中，NMVOCs正逐渐被认识为肾脏损伤的潜在环境contributor。本研究结果表明，较高的省级NMVOC排放负担与较高的CKD患病几率相关，SLC9A3被列为候选基因，单细胞分析提示近端小管细胞与成纤维细胞之间存在潜在的SPP1-ITGB1信号传导。既往VOCs健康评估在靶器官方面存在偏倚，多关注其导致血液系统肿瘤或呼吸及心血管疾病的作用。然而，肾脏接受高达20%–25%的心输出量，是核心排泄器官，因其分泌和重吸收毒素的作用，也可成为环境暴露的主要靶器官。近期基于大型人群队列的研究表明，尿液中VOC代谢物浓度升高与CKD风险增加及eGFR进行性下降显著正相关，本研究结果与该模式基本一致。与高剂量中毒所致的急性肾小管坏死不同，背景环境浓度NMVOCs暴露呈现隐匿性和进行性的慢性肾小管间质损伤及纤维化模式。结合分层分析，研究人员观察到肥胖参与者中该关联可被观察到，此现象可能部分与NMVOCs的高脂溶性及其特定毒代动力学特征有关。肥胖患者大量白色脂肪组织可能影响这些脂溶性毒素的分布，不仅大大减缓毒素经肝脏和肾脏的解毒和排泄，更关键的是，当日常能量波动触发脂解时，脂肪组织转变为毒素释放的内部来源，这种低剂量长期内部释放模式使肾实质细胞在外部污染停止后仍处于 prolonged 毒理学应激状态，加速肾小管的慢性耗竭。另一方面，肥胖诱导的全身代谢性炎症是协同加重肾损伤的另一潜在contributor。当NMVOCs经I相代谢转化为高活性中间体并引起局部ROS爆发时，肥胖的背景炎症与环境暴露引起的急性应激可能在肾小管间质中产生重叠效应，这些联合应激可能影响并耗竭肾脏内部抗氧化系统，进而触发大规模脂质过氧化和DNA氧化损伤。上述联合应激可能损害肾小管上皮细胞完整性，成为潜在contributing to细胞损伤和纤维化的关键病理基础。由SLC9A3编码的钠氢交换体3（NHE3）是肾近端小管关键的跨膜阳离子转运体，正常生理条件下依赖细胞内外钠浓度梯度重吸收原尿中约70%的滤过钠并分泌氢离子，是调节人体细胞外液容量、维持血压和酸碱平衡的关键分子枢纽。当近端小管受到NMVOCs诱导的早期氧化应激、脂质过氧化或微环境缺氧刺激时，即使细胞尚未达到不可逆坏死，其顶端刷状缘的肌动蛋白细胞骨架也会迅速发生病理性解聚，这种亚致死性应激可能促使大量锚定于顶端膜的NHE3蛋白复合物脱落，以exosome形式释放入尿。独立临床研究证实，在慢性毒素暴露的亚临床损伤阶段，尿中SLC9A3蛋白校正丰度可显著升高，且此上升趋势与肾脏局部早期促炎因子（如IL-6和TNF-α）表达水平高度正相关。此外，通过微环境纤维化级联反应的SPP1和ITGB1轴，受损近端小管细胞和微环境炎症招募的特定巨噬细胞亚群开始大量表达和分泌促纤维化介质SPP1，游离SPP1配体释放入间质液，利用其结构中保守结合域与静息成纤维细胞及部分周细胞表面的跨膜整合素ITGB1亚基受体高亲和力特异性结合，配体与ITGB1受体对接迅速激活跨膜生化信号转导，导致细胞内黏着斑激酶磷酸化，进而充分触发STAT3和ERK等炎症和增殖转录因子网络，该信号级联促使静息成纤维细胞发生显著表型转化，演变为高收缩性和基质合成活性、以α-SMA高表达为标志的肌成纤维细胞，最终过度活化的肌成纤维细胞持续合成并释放大量细胞外基质蛋白（如COL1A1、COL3A1和FN1）至微环境，密集且异常交联的基质过度沉积于肾小管间质，不仅压迫存活肾单位，还导致管周微血管网络退化 and 血流受损，使肾脏陷入更深缺氧。至此，环境中微小NMVOC排放负担触发的近端小管代谢异常，经单细胞通讯网络级联放大，最终发展为不可逆的终末期器质性肾间质纤维化。本研究从新视角分析了环境流行病学中的关联证据。首先，这些互补证据线索为SLC9A3/SPP1–ITGB1通路提供了初步支持。其次，基于机器学习的特征选择与单细胞分辨率下的微观机制分析的整合，为核心靶点SLC9A3的临床转化潜力提供了一定依据。最后，体外实验提供了概念验证证据，表明氢醌处理与肾小管上皮细胞中较高的SLC9A3和SPP1表达相关，而氢醌处理细胞的条件培养基增加了成纤维细胞迁移和α-SMA表达，这为SLC9A3/SPP1信号轴可能参与肾脏微环境通讯这一关键细胞学事件提供了支持性体外证据。然而，本研究也存在一定局限性。第一，暴露采用2015年省级排放清单赋值，同一省份所有参与者接受相同估计值，该生态代理未捕捉时间、空间或个体水平暴露变异，排放量不直接代表环境浓度或吸收剂量，因此研究发现反映的是省级NMVOC排放负担与肾功能状态之间的生态学关联，而非个体水平或因果关系。第二，eGFR <60 mL/min/1.73 m
2的定义可能遗漏早期肾损伤，未来研究应纳入多年、更高分辨率的暴露估计和尿液肾损伤生物标志物。第三，HQ仅代表苯相关代谢通路，不能重现真实世界NMVOC混合物的化学多样性或联合效应，因此这些实验提供的是HQ模型特有的概念验证证据，需要使用多种NMVOC母体化合物和代谢物进一步验证。最后，永生化大鼠细胞系不能完全重现人肾脏的细胞异质性或生物学反应，因此需要使用原代人近端小管上皮细胞和原代人肾成纤维细胞进一步验证。
结论部分翻译：总之，较高的省级NMVOC排放负担与较高的CKD患病几率相关。整合分析提名SLC9A3/SPP1-ITGB1信号传导为候选通路，并得到苯代谢物模型的概念验证支持。然而，尚需个体水平暴露评估、多化合物模型和靶向体内研究加以确认。
