《Cogent Food & Agriculture》：In vitro establishment of Olea europaea cv. Koroneiki using melatonin as a plant growth regulator
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油橄榄（Olea europaea L.）品种Koroneiki属木犀科（Oleaceae），为多用途树种，以初榨油生产著称，适于全球高密度栽培系统。因嫁接繁殖困难且具顽拗性（recalcitrant），Koroneiki需要高效的离体（in vitro）方案
油橄榄（Olea europaea L.）品种Koroneiki属木犀科（Oleaceae），为多用途树种，以初榨油生产著称，适于全球高密度栽培系统。因嫁接繁殖困难且具顽拗性（recalcitrant），Koroneiki需要高效的离体（in vitro）方案以实现繁殖与保存。研究测试了三种基础培养基——Murashige and Skoog（MS）、橄榄培养基（OM）和木本植物培养基（WPM），针对叶片和节段两类外植体进行愈伤组织诱导与芽再生。外植体经70%乙醇处理10秒，再用0.1%升汞处理3分钟，并在层流超净台下用高压灭菌蒸馏水冲洗4–5次，被视为Koroneiki最适宜的消毒方案。节段外植体在含9.12 μM褪黑素（melatonin）+ 17.7 μM BAP的OM培养基上，于黑暗和光照条件下均观察到最大愈伤组织诱导率（70%）。含BAP与褪黑素组合的WPM在光照下经节段外植体获得67%愈伤组织诱导。叶片外植体在黑暗条件下观察到50%愈伤组织诱导响应，但光照下无愈伤组织形成。
研究背景：油橄榄（Olea europaea L.）品种Koroneiki属木犀科，被誉为"油橄榄皇后"，原产希腊，现广泛分布于亚洲、非洲、欧洲和澳大利亚，尤以地中海盆地栽培最为集中。该品种以初榨油生产闻名，橄榄油富含油酸，被 UNESCO 列入世界非物质文化遗产，并用于治疗肥胖、癌症、代谢综合征、心血管疾病和2型糖尿病。近三十年来世界橄榄油产量从1874千吨增至2881千吨。全球约1250个品种在54个国家约1080万公顷面积上栽培。然而，油橄榄传统繁殖方式存在明显局限：扦插仅适用于健康母株且需在春季进行，生根高度依赖品种与营养条件；嫁接难度大且需熟练人员；油橄榄幼年期长，营养繁殖呈顽拗性（recalcitrant）。微繁殖（micropropagation）虽具繁殖速度快、可保存遗传资源等优势，但油橄榄因顽拗性、高污染率和芽伸长周期长而面临挑战，且各品种对营养和生长调节剂需求特异，需品种特异性方案。褪黑素（N-acetyl-5-methoxytryptamine）为由色氨酸合成的多功能信号分子，具类生长素（auxin-like）特性，可促进细胞分裂、伸长、不定根形成、芽增殖和器官发生，并具强抗氧化能力。鉴于油橄榄油需求增长及传统繁殖问题，研究人员旨在建立以褪黑素为高效低成本生长调节剂的离体技术，优化外植体类型、消毒方案、培养条件及褪黑素在愈伤组织诱导和芽增殖中的作用。
研究方法：研究人员从巴基斯坦Barani农业研究所（BARI）获取健康无病认证的Koroneiki植株，于旁遮普大学植物研究所露天种植，2020年12月初从5年生树上采集叶片和节段外植体。比较两种消毒方案：方案一为流水冲洗15分钟、15%洗涤剂处理15分钟、70%乙醇10秒、0.1%升汞3分钟；方案二为高压灭菌蒸馏水30分钟、70%乙醇10秒、0.75% NaClO 10分钟。测试MS、OM和WPM三种基础培养基，每种设6个处理：对照（无激素）、BAP（8.8和17.7 μM）、褪黑素（4.56和9.12 μM）及BAP（17.7 μM）+褪黑素（9.12 μM）组合。培养条件为pH 5.7–5.8、121°C高压灭菌15分钟、25±2°C，一半培养物置于黑暗，另一半置于40 μmol m?2 s?1冷白光下16小时光周期。芽再生实验在三种基础培养基中添加BAP、褪黑素和NAA（0.123 μM）单用或组合。采用随机完全区组设计（RCBD），每处理3次重复，实验重复3次，数据经SPSS 20.0单因素方差分析和Duncan多重极差检验比较。
研究结果：
3.1 消毒与无菌培养建立：方案一（0.1%升汞3分钟）污染率为50%，方案二为85%，故采用方案一。
3.2 MS和OM培养基上节段与叶片外植体的愈伤组织诱导：MS培养基节段外植体愈伤组织诱导率为0%，25–30天后外植体坏死变褐，故不再用于后续实验。OM单独添加BAP或褪黑素均无愈伤组织形成；OM含17.7 μM BAP + 9.12 μM褪黑素（C6）在黑暗和光照下均获70%愈伤组织诱导，光照下愈伤组织诱导较早（44天）于黑暗（53天），黑暗诱导的愈伤组织呈奶油色致密，光照诱导的呈深绿色。叶片外植体在MS上无愈伤组织，OM三个处理（C3、C5、C6）可诱导愈伤组织：9.12 μM褪黑素单独诱导率66.7%（黑暗和光照下74–79天）；17.7 μM BAP诱导率33.4%和30%（65和68天）；BAP+褪黑素组合诱导率33%和30%（60和61天），愈伤组织呈奶油色、致密颗粒状，光照下呈绿色。
3.3 WPM培养基上的愈伤组织诱导：节段外植体在无激素WPM黑暗下诱导13.4%白色颗粒状疏松愈伤组织，光照下无；9.12 μM褪黑素黑暗下诱导20%奶油白色致密愈伤组织，光照下无；17.7 μM BAP + 9.12 μM褪黑素在光照下诱导67%翠绿色致密愈伤组织，黑暗下无；8.8 μM BAP、17.7 μM BAP和4.56 μM褪黑素单独均无诱导。叶片外植体仅9.12 μM褪黑素单独或与17.7 μM BAP组合在黑暗下分别诱导30%和50%愈伤组织。总体而言，褪黑素（9.12 μM）单独效果优于BAP，而WPM含BAP+褪黑素组合对叶片外植体光照下诱导效果最佳。
3.4 芽增殖：MS培养基所有处理均无再生响应，20天后外植体变褐坏死。OM所有处理均支持芽再生：无激素OM 84天后形成1.3个芽；9.12 μM褪黑素效果优于BAP单独，芽长1.3 cm、叶片数3.3；BAP（17.7 μM）+褪黑素（9.12 μM）诱导最高芽长（1.5 cm）和最多叶片数（3.5）；9.12 μM褪黑素获最多芽数（2）和叶片数（3.3）。WPM上BAP、褪黑素及组合均可诱导芽：9.12 μM褪黑素获最多叶片数（3.6）和芽数（1.3）；褪黑素+BAP组合33天后获最大芽长（1.2 cm）、芽数（1.5）和叶片数（3.3）；褪黑素单独叶片数（1.6）和芽数（1）最少。BAP+褪黑素组合的芽萌发和出叶时间最短。
讨论部分总结：油橄榄离体繁殖因顽拗性和污染而极具挑战，田间和离体组织均携带大量微生物污染，有效消毒方案是微繁殖成功的先决条件。本研究采用幼嫩节段和叶片外植体，70%乙醇15秒后0.1%升汞3分钟消毒效果最佳，与Zacchini和De Agazio（2004）报道一致。自90年代以来虽使用多种外植体，但仅少数品种成功微繁殖，节段外植体通常被视为最适来源。各物种因基因型不同对营养需求各异，需确定各基因型适宜培养基。MS培养基因有机或无机盐浓度高，可诱导木本植物生理胁迫和组织毒性，导致外植体褐化，本研究MS上两种外植体均无愈伤组织且10–15天后严重褐化。愈伤组织诱导率不仅取决于外植体类型，还取决于培养基和适宜生长调节剂浓度。OM含17.7 μM BAP + 9.12 μM褪黑素获最高愈伤组织诱导率（70%），叶片外植体以9.12 μM褪黑素单独效果最佳（66.7%），但诱导期较长（74–79天）。WPM光照下BAP+褪黑素组合经节段外植体诱导67%愈伤组织。OM总体优于WPM。MS再次未能诱导任何形态发生响应，OM在添加生长调节剂时芽形成、芽数和芽长最高。无激素OM芽再生最低，WPM无响应。褪黑素与细胞分裂素（cytokinin）间存在正交互作用，油橄榄因强顶端优势次生腋芽形成较少。BAP主要通过细胞分裂素途径刺激细胞分裂，褪黑素通过缓解氧化胁迫、激素调控、代谢增强和维持细胞稳态等多重互补机制增强再生。研究结论：本研究成功建立了Koroneiki愈伤组织诱导和芽再生的高效方案，节段外植体形态发生潜力最高，OM为最适基础培养基，MS因严重褐化无效，17.7 μM BAP + 9.12 μM褪黑素组合显著增强愈伤组织诱导、芽再生和芽生长，证明褪黑素在油橄榄微繁殖中的积极作用。该研究有助于优良基因型快速繁殖、珍贵种质保存、无病种植材料生产及遗传转化、基因组编辑和次生代谢物增强等先进生物技术应用，褪黑素与细胞分裂素的协同效应增进了对木本植物褪黑素介导形态发生调控的理解。
