《Current Plant Biology》：Methylome and Transcriptome Analyses Reveal Epigenomic Remodeling Associated with Leaf Color Variation in the New Jujube Cultivar ‘Ruiyun’
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对'瑞云'枣三个叶色表型的色素含量和叶绿体结构进行比较，发现白化叶表型最差。CHLH和PDS的差异DNA甲基化显著改变其表达，从而调控色素生物合成途径。DNA甲基化可能通过调控色素代谢来控制叶色变异，为枣树叶色突变提供表观遗传学证据。高等植物叶片颜色丰富多样，
对'瑞云'枣三个叶色表型的色素含量和叶绿体结构进行比较，发现白化叶表型最差。CHLH和PDS的差异DNA甲基化显著改变其表达，从而调控色素生物合成途径。DNA甲基化可能通过调控色素代谢来控制叶色变异，为枣树叶色突变提供表观遗传学证据。高等植物叶片颜色丰富多样，由叶绿素、类胡萝卜素和花青素等色素的组成、含量和比例决定。叶绿素是光合作用必需的色素。叶色变异是植物中较为常见的突变类型，多数自然发生，常在苗期表现明显表型，是研究叶绿素生物合成、叶绿体结构发育和光合调控机制的理想材料。水稻、小麦、黄瓜、茶树和银杏等物种中已鉴定出大量叶绿素和叶绿体相关的叶色突变体，表型包括黄芽、条纹、白化、斑马纹、花斑和浅绿等。其中，叶片白化在多数作物中被证明是不利性状，导致生长迟缓和产量损失，并伴随叶绿体结构异常、光合效率降低和色素积累受限。叶色突变体的机制高度复杂，主要受遗传因素影响。例如，叶绿素和类胡萝卜素生物合成与降解相关基因的突变可影响叶绿体分化和发育，导致叶绿体功能障碍。茶树中POR和SGR突变降低叶绿素含量；沉默参与类胡萝卜素代谢的PDS和ZDS导致叶片和愈伤组织白化表型。DNA甲基化是一种关键的表观遗传修饰，在基因表达调控、基因组稳定性维持、转座子沉默、基因组印记和环境响应等多种生物学过程中发挥重要作用。其中，胞嘧啶甲基化（5-甲基胞嘧啶，5mC）是最普遍的形式，在植物中已被广泛研究。其主要发生在三种序列背景——CpG、CHG和CHH（H = A、T或C）——并由DNA甲基转移酶（动物中如DNMTs；植物中为DRM/CMT/MET）动态调控。随着测序技术的进步，全基因组DNA甲基化检测方法日益完善。其中，亚硫酸氢盐测序（BS-seq）是分析5mC甲基化最广泛使用的方法，能够在所有序列背景（CG、CHG和CHH）下以单碱基分辨率检测全基因组5mC，提供甲基化组图谱。该方法与转录组测序结合，已成功应用于茶树、苹果、桦树、金银花和葡萄等植物中DNA甲基化与颜色突变相关的研究，促进了性状相关基因的鉴定。与此一致，DNA甲基化已被牵涉到多种植物的叶色调控中。例如，OsGUN4启动子的CHG超甲基化导致水稻黄叶；小麦中低温诱导的TaPOR2D启动子超甲基化（93% vs. 0%）伴随白化表型，过表达可恢复叶绿素含量；小麦ZKNM1斑点叶中HEMA1和PORA的下调与上游区域超甲基化相关。此外，类胡萝卜素生物合成和降解基因LjPSY1、LjPDS1、LjLCYE和LjCCD4的表达水平受低甲基化改变，表明DNA甲基化在花色变异中起重要作用。枣（Ziziphus jujuba Mill.）是中国原产的经济重要果树，果实营养丰富且具有显著药用价值。'瑞云'是新品种，研究人员于2024年从国家林业和草原局新品种保护办公室获得植物新品种权证书。该品种幼苗表现出三种明显的叶色表型：全绿、白绿花斑和纯白。叶色突变在枣中罕见且研究不足。尽管其他植物中已有叶色突变研究，但枣中尚未开展甲基化组和转录组的联合分析。因此，选择具有三种稳定叶色表型的'瑞云'作为本研究的实验材料。为阐明DNA甲基化在调控'瑞云'叶片色素化中的作用，对三种叶片类型进行了全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）和转录组测序。研究旨在鉴定与三种叶色表型间色素含量和叶绿体发育相关的差异甲基化区域及相关基因。该工作可能为'瑞云'叶色变异的分子机制提供新见解。
研究背景：高等植物叶片颜色由叶绿素、类胡萝卜素和花青素等色素的组成、含量和比例决定。叶色变异是常见的植物突变类型，多数自然发生，常在苗期表现明显表型，是研究叶绿素生物合成、叶绿体结构发育和光合调控机制的理想材料。叶片白化在多数作物中被证明是不利性状，导致生长迟缓和产量损失，并伴随叶绿体结构异常、光合效率降低和色素积累受限。叶色突变体机制高度复杂，主要受遗传因素影响，叶绿素和类胡萝卜素生物合成与降解相关基因突变可影响叶绿体分化和发育。DNA甲基化是关键表观遗传修饰，在基因表达调控等多种生物学过程中发挥重要作用。胞嘧啶甲基化（5mC）是最普遍形式，主要发生在CpG、CHG和CHH三种序列背景，由DNA甲基转移酶动态调控。亚硫酸氢盐测序（BS-seq）是分析5mC甲基化最广泛使用的方法，与转录组测序结合已成功应用于茶树、苹果、桦树、金银花和葡萄等植物DNA甲基化与颜色突变相关研究。枣是原产中国的经济重要果树，'瑞云'是新品种，幼苗表现出全绿、白绿花斑和纯白三种明显叶色表型。叶色突变在枣中罕见且研究不足，枣中尚未开展甲基化组和转录组联合分析。因此，研究人员选择具有三种稳定叶色表型的'瑞云'，对三种叶片类型进行全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）和转录组测序，旨在鉴定与色素含量和叶绿体发育相关的差异甲基化区域及相关基因。
主要关键技术方法：研究以自然发生的'瑞云'叶色嵌合幼苗为材料，从同一单株采集绿色叶（GL）、花斑叶（SL）和白化叶（WL）三种嵌合芽组织，每种叶型三个独立生物学重复，置于25 °C、16 h光照/8 h黑暗光周期温室培养两年。采用95%乙醇提取叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素和类胡萝卜素并分光光度法测定。石蜡切片结合番红-固绿染色观察叶片显微结构，透射电子显微镜（TEM）观察叶绿体超微结构。基因组DNA经超声破碎、末端修复、加A尾、连接甲基化测序接头、亚硫酸氢盐转化和PCR扩增构建文库，在Illumina HiSeq? 2500平台测序，clean reads用BSMAP比对枣参考基因组（ASM2079620v1，Ziziphus jujuba var. spinosa），鉴定差异甲基化区域（DMRs）。总RNA提取后构建cDNA文库，在Illumina NovaSeq 6000平台测序，clean reads用HISAT2比对参考基因组，StringTie组装转录本，RSEM计算FPKM，DESeq2鉴定差异表达基因（DEGs）。采用亚硫酸氢盐测序PCR（BSP-PCR）验证关键DMRs，qRT-PCR验证基因表达，以UBQ为内参基因，2-ΔΔCT法计算相对表达量。
研究结果：
3.1 '瑞云'枣叶片形态和解剖特征：WL叶片较小且边缘卷曲，叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b和类胡萝卜素含量显著低于GL，SL居中。GL叶肉细胞发育良好，栅栏组织和海绵组织清晰，含形态规则的叶绿体；WL栅栏和海绵组织紊乱，叶肉细胞稀疏；SL表现中间表型。超微结构显示GL叶绿体基质中含丰富淀粉粒和嗜锇颗粒，WL叶绿体结构严重破坏，基质不明显，基粒和类囊体膜几乎不可见，无淀粉粒；SL叶绿体超微结构介于GL和WL之间。
3.2 不同枣叶全基因组亚硫酸氢盐测序：构建GL/SL、GL/WL和SL/WL三个配对文库，各文库产生7390万–7860万高质量clean reads，比对率80.48%–81.09%，亚硫酸氢盐转化率98.85%、98.88%和98.75%。mC频率在CHH位点最高（约45%），CG和CHG位点较低（28.14%–28.47%和26.12%–26.75%）。
3.3 枣叶不同基因组区域的DNA甲基化图谱：CG位点平均甲基化水平高于CHG和CHH，CHH甲基化水平最低。CG甲基化在内含子区域最高，其次为编码区、下游区和上游区。在所有检测区域中CG甲基化水平始终高于CHG和CHH，CHH在所有区域甲基化水平最低。
3.4 不同枣叶的差异甲基化区域：GL/SL检测到8671个DMRs，GL/WL为17373个，SL/WL为7921个。GL/SL鉴定出11293个DMR相关基因，GL/WL为26348个，SL/WL为11496个；DMR相关启动子在GL/SL为1801个，GL/WL为3857个，SL/WL为1617个。GL/SL和GL/WL中超甲基化DMR相关基因和启动子数量超过低甲基化，SL/WL相反。GO分析显示DMR相关基因和启动子参与结合、代谢过程、细胞过程、细胞解剖实体和生物学调控等生物学过程。KEGG富集分析表明DMR相关基因显著富集于氨基酸生物合成、类胡萝卜素生物合成和次生代谢物生物合成途径。
3.5 三种枣叶的差异基因表达：GL/SL、GL/WL和SL/WL比较分别鉴定出2838个（1161上调、1677下调）、4273个（2193上调、2080下调）和1308个（628上调、680下调）DEGs。GL/SL和SL/WL中下调基因多于上调基因，GL/WL相反。KEGG分析显示DEGs显著富集于光合作用、类黄酮生物合成、类胡萝卜素生物合成等途径。三个比较共鉴定出206个共同DEGs，显著富集于代谢途径、次生代谢物生物合成、光合作用和光合作用-天线蛋白。DEGs中检测到365个转录因子编码基因，包括GL/SL中133个、GL/WL中177个、SL/WL中55个，属于MYB/MYB-related、bHLH、ERF、NAC、WRKY、bZIP、C2H2、LBD和C3H等基因家族。
3.6 叶绿素生物合成途径和类胡萝卜素代谢途径相关DEGs分析：叶绿素生物合成途径鉴定出12个DEGs，包括HEMA、GSA、UROS、HEME、CHLH、CHLI、CHLD、GUN4、CHLM、CRD1、CAO和CHLG。GL/SL中GSA、CHLI、CHLD、GUN4和CHLG表达上调；GL/WL和SL/WL中HEME和CHLH表达上调。类胡萝卜素生物合成途径鉴定出6个DEGs，包括PSY、PDS、ZDS、VDE、CCS和NCED。GL/SL中VDE、CCS和NCED显著上调，提示其在类胡萝卜素降解中的潜在作用。
3.7 不同枣叶DMRs与DEGs的相关性分析：GL/WL组含有最高数量的DMRs、DMR相关基因、DEGs和DMR相关DEGs。CG背景下这些指标始终最高，GL/WL中基因体CG型DMRs为5763个，DMR相关基因2772个，DEGs 4078个，DMR相关DEGs 426个，占比10.45%，高于GL/SL（5.47%）和SL/WL（5.64%）。CG和CHH背景下大多数低甲基化DEGs表达显著高于超甲基化对应基因，CHG背景下无显著差异。
3.8 参与叶绿素和类胡萝卜素生物合成途径的DMR相关DEGs：与GL相比，WL中PDS基因体CG低甲基化（meth.diff = ?37.87，p = 1.78e?12）和启动子CHH超甲基化（meth.diff = 26.37，p = 3.23e?28），伴随显著下调（log2FC = ?1.04，p = 5.97e?10）。与GL相比，SL中CHLH基因体CHH超甲基化（meth.diff = 26.22和21.26，p = 5.20e?14和2.45e?18）并显著下调（log2FC = ?1.35，p = 8.69e?4）。两个基因中甲基化变化与表达负相关。
3.9 DNA甲基化和基因表达数据验证：BSP-PCR结果与甲基化组分析一致。选取7个参与叶绿素和类胡萝卜素生物合成途径的基因（HEMA、CHLD、CRD1、PSY、PDS、NCED、CHLH）进行RT-qPCR验证，表达趋势与RNA-Seq分析一致。
讨论部分总结：研究表明DNA甲基化在调控植物色素合成中起关键作用。本研究旨在阐明DNA甲基化如何调控'瑞云'叶色变异，结果揭示DNA甲基化修饰与叶绿素和类胡萝卜素生物合成途径关键基因表达水平显著相关。植物叶色变异与色素合成降解、叶绿体发育及核质信号调控等因素相关。叶绿体是叶绿素和类胡萝卜素生物合成的细胞器，其缺陷可影响色素含量和比例。本研究结果与苹果和茶树中的发现一致：GL叶绿素和类胡萝卜素含量高于SL和WL；SL和WL突变体叶绿体结构和数量与GL存在差异，WL叶肉细胞稀疏、叶绿体退化和受损、数量减少。全基因组DNA甲基化数据显示，叶色变异程度与全基因组甲基化重编程程度相关，表型差异越大，全局DNA甲基化变化越明显。GL/WL组DMRs、DMR相关基因和DMR相关启动子数量显著高于其他两组。SL/WL组低甲基化和超甲基化基因及其启动子分布趋势与GL/SL和GL/WL完全相反，表明不同叶色枣叶具有不同DNA甲基化修饰特征。转录组分析鉴定的DEGs显示GL/SL和SL/WL以下调基因主导，GL/WL以上调基因显著富集。即使在重叠最强的CG基因体类别中，仅约5%–10%的DEGs可由DMR相关基因解释，表明DNA甲基化可能在一定程度上调控部分色素生物合成和分解代谢基因表达，但可能与其他调控机制协同作用而非主导调控因子。整合分析表明CG和CHH背景下低甲基化基因表达显著高于超甲基化对应基因，CHG甲基化水平与基因表达无显著相关，提示CG和CHH甲基化可能是调控枣叶基因转录的核心抑制性表观遗传修饰。CG型DMRs对应最大数量的DMR相关基因、DEGs和共定位差异表达基因，GL/WL组中CG型DMRs相关差异基因比例显著高于其他两组。色素代谢途径分析显示叶绿素生物合成途径中CHLH基因体超甲基化伴随表达上调，可能参与叶绿素生物合成；类胡萝卜素代谢途径中PDS启动子和基因体超甲基化伴随表达抑制，可能导致类胡萝卜素生物合成减少；色素分解代谢基因VDE、CCS和NCED在GL/SL中显著上调。研究局限性包括：所用材料无已发表高质量染色体水平基因组，使用酸枣基因组作为参考可能引入比对和注释偏差；研究仅表明DNA甲基化修饰与CHLH和PDS表达水平显著相关，缺乏甲基化位点和功能验证实验；甲基化变化可能是叶绿体功能异常的下游结果而非色素变化的上游原因，未来需时序实验、遗传杂交或靶向调控甲基化相关基因以阐明因果关系。
研究结论翻译：研究人员分析了枣'瑞云'三种不同叶色类型的叶绿素含量、细胞结构、甲基化组和转录组图谱。在GL/SL中，CHLH显示基因体超甲基化伴随表达上调，可能促进叶绿素生物合成。在GL/WL中，PDS显示启动子和基因体超甲基化伴随表达下调，可能抑制类胡萝卜素合成。这些结果表明DNA甲基化可能通过调控色素生物合成和降解参与叶色形成，为枣叶色变异的表观遗传调控提供多组学证据。然而，DNA甲基化并非枣叶色变异的唯一或主导决定因素，可能与其他调控机制协同作用。
