《Food Hydrocolloids for Health》：Optimized Extraction and Characterization of κ/ι-Carrageenan from
Mazzaella japonica: Antioxidant, Antibacterial and Anti-inflammatory Activities
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海藻来源的生物活性化合物具有多种健康促进特性，包括抗氧化、抗炎、抗菌和益生元活性。由于这些多功能益处，海藻提取物在制药、营养保健品、功能性食品和化妆品中的应用日益受到关注，有助于疾病预防、治疗干预和整体健康改善。本研究首次对Mazzaella japon
海藻来源的生物活性化合物具有多种健康促进特性，包括抗氧化、抗炎、抗菌和益生元活性。由于这些多功能益处，海藻提取物在制药、营养保健品、功能性食品和化妆品中的应用日益受到关注，有助于疾病预防、治疗干预和整体健康改善。本研究首次对Mazzaella japonica提取物的药学潜力进行了全面研究，采用粒径缩减结合创新、快速、绿色的加热方法，包括亚临界水提取（SBWE）作为环境友好的提取介质。所开发并验证的提取工艺能够从红藻M. japonica（红藻门）中优化回收关键生物活性化合物，尤其是κ-和ι-卡拉胶，并证实其具有抗菌、抗氧化和抗炎活性。结果表明，25–53 μm的粒径范围结合特定时长的SBWE可获得最高水平的总碳水化合物、葡萄糖醛酸、酚类和黄酮类化合物，以及最强的抗氧化、抗菌和抗炎活性。此外，利用RAW264.7细胞确认了海藻提取物的安全性，并通过Caco-2单层培养中的跨上皮电阻（TEER）测量进一步验证。综上所述，研究结果强调了优化绿色提取工艺在从M. japonica中生产安全、高价值生物活性化合物方面的成功，突出了其在海藻基功能性食品和营养保健品中的应用前景。
海藻（大型藻类）是一类包含9000余种海洋物种的多样化生物群，根据色素分为绿藻、褐藻和红藻。海藻可产生多种生物活性化合物，包括多糖、多酚和必需脂肪酸，具有抗氧化、抗炎和抗菌活性。这些化合物的组成和产量因物种、环境、采收季节和加工方法而异。
Mazzaella japonica是一种重要的商业化红藻，原产于日本、朝鲜半岛和俄罗斯的太平洋沿岸，现广泛分布于加拿大不列颠哥伦比亚省（BC）海岸线。该藻富含藻胆蛋白和卡拉胶，其蛋白质水解物含有ACE抑制肽以及酚类、多糖和甾醇等其他生物活性化合物。尽管
M. japonica富含宝贵的生物活性成分，但研究空白仍然存在，特别是在其生物活性化合物的全面化学表征、提取物分析以及与人健康相关的生物活性评价方面。海藻生物活性化合物提取工艺的优化是最大化其作为药物和营养保健品应用的关键要素。传统提取方法如溶剂提取和水蒸馏面临环境影响和提取效率方面的挑战。相比之下，绿色提取工艺旨在通过环境友好技术回收生物活性化合物，消除有毒溶剂的使用并促进可持续实践。为从海藻中以更高效率和增强生物活性分离生物活性化合物，已开发多种绿色提取方法，如酶辅助提取、超声辅助提取、微波辅助提取和亚临界水提取（SBWE）。研究人员利用优化的绿色提取方法证实，减小粒径可显著提高受试海藻生物活性化合物的提取率，尤其是与涉及微波能和高压力短暂创新加热技术配合时。在这些验证方案中，研究人员开发并实施了独特方法，以优化从两种不同大型藻类——
Ulva lactuca（绿藻门）和
Ascophyllum nodosum（褐藻纲）——中提取抗菌、抗氧化和抗炎生物活性化合物。因此，研究人员假设新型绿色提取方法将增强
M. japonica生物活性成分的回收，旨在开发安全有效的营养保健品以支持和改善人类健康。据此，采用不同绿色提取方法从
M. japonica中提取生物活性多糖，并评价其体外抗菌、抗氧化和抗炎活性。
在方法学方面，干燥的
M. japonica样品经研磨后使用筛分仪分级为五个粒径组分（<25 μm、25–53 μm、53–106 μm、106–355 μm和>355 μm）。不同粒径组分（5 g）悬浮于50 mL Milli-Q水中（0.1% w/v），采用热水提取（HWE，包括水浴和加热板两种方式）、微波辅助提取（MEP，450、630或900 W）和亚临界水提取（SBWE）进行提取。采用高效体积排阻色谱（HP-SEC）测定多糖分子量，傅里叶变换红外光谱（FTIR）和核磁共振（NMR，包括1H、13C及二维谱）进行结构表征。采用苯酚-硫酸法测定总碳水化合物，试剂盒测定葡萄糖醛酸，Folin–Ciocalteu法测定总酚含量（TPC），试剂盒测定总黄酮含量（FC），BCA法测定蛋白含量。抗氧化活性采用总抗氧化能力（TAC） assay和DPPH自由基清除 assay评价，结果以Trolox当量表示。抗菌活性针对金黄色葡萄球菌（
S. aureus ATCC 6538）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA ATCC 33592）、大肠杆菌O157:H7、铜绿假单胞菌（
P. aeruginosa ATCC 15442）和鼠伤寒沙门氏菌（
S. typhimurium ATCC 1535）进行评估，测定最小抑菌浓度（MIC）、时间-杀菌动力学、生物膜形成抑制和最小生物膜根除浓度（MBEC）。细胞实验使用HaCaT人角质形成细胞、RAW264.7鼠巨噬细胞和Caco-2人结直肠腺癌细胞。采用AlamarBlue法评估细胞活力和增殖，PI染色评估膜完整性，划痕实验评估细胞迁移，qPCR测定TNF-α和TGF-β1基因表达，Griess法测定NO产生，LAL显色法测定内毒素含量，TEER测量评估肠道屏障完整性。统计分析采用GraphPad Prism进行双因素方差分析和t检验，p≤0.05为显著性阈值。
结果部分：3.1 粒径缩减对提取效率的影响。3.1.1 总碳水化合物和总葡萄糖醛酸含量——
M. japonica碳水化合物提取效率明显依赖于生物质粒径，25–53 μm组分在所有提取方法中产量最高。<25 μm和25–53 μm组分之间碳水化合物产量无显著差异（P=0.97）。25–53 μm组分结合SBWE获得最高碳水化合物产量，与其他提取方案相比差异极显著（p<0.0004）。葡萄糖醛酸产量随提取时间延长而增加，SBWE和MEP@900 W获得最高产量，两者间无显著差异。与碳水化合物不同，减小粒径未显著增强葡萄糖醛酸回收（P=0.54）。3.1.2 植物化学评价——减小粒径在所有提取方案中显著增加酚类产量（P<0.0001），25–53 μm组分结合SBWE和HWE-H.P获得最高酚类产量（P=0.65）。减小粒径在所有提取方案中显著增强黄酮含量，25–53 μm组分结合MEP@900 W、MEP@450 W和HWE-H.P获得最高黄酮含量（分别为0.82、0.79和0.76 mg槲皮素/g藻），三者间无显著差异（P=0.131）。3.1.3 蛋白含量——减小粒径显著增加所有提取物的蛋白产量，25–53 μm组分结合SBWE和HWE-H.P获得最高蛋白产量（分别为49.8和43.5 mg蛋白/g藻），两者间无显著差异（P=0.183）。3.2 药理和营养保健品活性。3.2.1 抗氧化潜力——TAC assay显示抗氧化活性与粒径缩减呈明显相关，25–53 μm组分结合MEP@630 W、HWE-H.P、MEP@900 W和SBWE获得最高抗氧化活性（3.78、3.68、3.57和3.46 μg Trolox当量/g藻），四者间无显著差异（p=0.862），且显著高于>355 μm组分（P≤0.0001）。SBWE提取物的DPPH IC??值为2 μg/mL。基于TPC、TFC、总蛋白产量和抗氧化 assay结果，25–53 μm粒径结合SBWE 60 min被选为优化提取条件。3.2.2 MIC测定和细菌时间-杀菌动力学——提取物抑菌呈剂量依赖性，处理18 h后对
S. aureus、
P. aeruginosa、
S. Typhimurium和APEC观察到显著生长抑制，对
E. coli和MRSA效果中等至较弱。5 mg/mL M-SBWE处理18 h对
S. aureus和APEC的细菌活力分别降低37.5%和46.4%，对应5-log细菌计数降低，IC??分别为0.62和0.63 mg/mL。3.2.3 生物膜 assay——M-SBWE对APEC、MRSA和
S. aureus显示强抗生物膜活性，对
P. aeruginosa和
S. Typhimurium中等，对
E. coli弱。M-SBWE抑制APEC、
E. coli和
S. Typhimurium成熟生物膜的进一步生长，MBEC分别为2.5、2.73和2.76 mg/mL。3.2.4 M-SBWE对角质形成细胞活力和功能的影响。3.2.4.1 HaCaT细胞活力、增殖和迁移——M-SBWE在大多数测试浓度（1–1000 μg/mL）维持高细胞活力（接近或高于90%）。最高浓度（1000 μg/mL）观察到轻微但显著的活力下降（p=0.0173），极低浓度（1–4 μg/mL）显著增强活力10–14%。增殖 assay显示24 h时细胞增殖接近未处理对照（99.84%），48 h轻微下降（91.24%），72 h进一步下降（84.42%）。低浓度（1–4 μg/mL）显著促进HaCaT增殖（约10–14%增加），反映双相毒物兴奋效应。3.2.4.2 基因表达——M-SBWE处理显著上调TNF-α（2.29±0.44%），而TGF-β1表达保持极低（0.06±0.61%）。划痕实验中M-SBWE未增强伤口闭合，PI染色确认>90%细胞活力，表明缺乏迁移并非由于细胞毒性。3.3.5 RAW264.7巨噬细胞：细胞活力和NO抑制。3.3.5.1 细胞活力——M-SBWE在RAW264.7细胞上的非毒性浓度（细胞活力≥90%）阈值为0.16 mg/mL。非毒性剂量M-SBWE（0.16 mg/mL）与LPS（100或0.1 μg/mL）联合对细胞活力无显著影响（P=0.11）。3.3.5.2 NO产生 assay——LPS诱导后，M-SBWE（0.16 mg/mL）未显著改变培养滤液中NO水平（P<0.95）。值得注意的是，单独M-SBWE处理促进未刺激RAW264.7细胞的NO合成（63 μM），但水平低于LPS触发量。3.3.6 体外安全性分析。3.3.6.1 内源性内毒素水平——2 mg/mL M-SBWE含1.78 EU/mL内毒素，1 mg/mL含1.46 EU/mL（对应0.02 ng/mL LPS），不足以触发NO合成。3.3.6.2 Caco-2细胞活力和屏障完整性——0.5–2.5 mg/mL提取物浓度为非毒性（P=0.981），TEER测量显示处理后无显著改变，支持其安全性。3.4 理化性质。3.4.1 HPLC-SEC分子量分布——纯化M-SBWE多糖组分显示主峰对应平均分子量约305 kDa，多分散指数（PI）为5.3。3.4.2 FTIR结构特征——光谱显示1637、1374、1220、1155、1126、1066、1027、929、844、805、700和576 cm?1处特征吸收带，分别归属C=C伸缩、羧酸O–H弯曲（糖醛酸残基）、S=O不对称伸缩（硫酸基）、C–O–C和C–O伸缩（糖苷键和吡喃环）、3,6-脱水半乳糖C–O振动、硫酸酯C–O–S伸缩等，确认M-SBWE为化学多样性的硫酸化多糖。3.4.3 NMR表征——主要成分为κ-和ι-卡拉胶，θ-卡拉胶含量与ι-卡拉胶相似。检测到可能的前体单元包括μ-卡拉胶和ν-卡拉胶，但部分化学位移与文献值不符，鉴定仍为暂定。G4S和DA2S的化学位移确认了κ-和ι-卡拉胶结构。
讨论部分：大型藻类作为药物化合物来源的潜力近年来引起集中科学兴趣。传统提取方法依赖有害有机溶剂，可能导致不良杂质共提取。为解决传统方法的局限并提高效率和产量，已开发多种新兴提取技术如微波辅助提取、超临界流体提取和酶辅助提取。研究人员此前开发了六种环境友好技术从绿藻和褐藻中回收生物活性化合物，并通过减小粒径增强方案效力。本研究中，研究人员测试了提取方法结合粒径缩减从红藻
M. japonica中回收生物活性化合物的效力。研究发现，最优时间和最小粒径下的高压灭菌方案获得最高提取产量以及最高总碳水化合物、葡萄糖醛酸、酚类和黄酮含量，并实现最强的总抗氧化、抗菌和抗炎活性。SBWE方案中水在100°C至132°C间维持足够压力保持液态，具有增强的溶解力、改善的扩散性和较低粘度，允许高效选择性提取。与先前研究一致，将SBWE与粒径缩减整合显著改善生物活性化合物回收。与已报道的
M. japonica最大TPC（约300 mg GAE/100 g）相比，本研究绿色提取方案结合粒径缩减实现TPC产量翻倍（约600 mg GAE/100 g），DPPH自由基清除活性也翻倍（400 mg Trolox当量/100 g vs 200 mg）。M-SBWE对
S. aureus、
P. aeruginosa、
S. Typhimurium和APEC显示显著生长抑制，并强效抑制APEC、
E. coli和
S. Typhimurium成熟生物膜。这是首次证明
M. japonica提取物对多种革兰阳性和革兰阴性人类病原菌的抗菌作用。NMR分析表明提取物主要成分为κ-和ι-卡拉胶，可能贡献于抗菌活性。NO是主要由诱导型一氧化氮合酶（iNOS）产生的关键信号分子。卡拉胶对NO产生的影响高度依赖分子量。本研究中M-SBWE（富含高分子量卡拉胶）在无LPS时诱导RAW264.7细胞培养上清中显著NO浓度（63 μM），但在LPS存在时拮抗LPS诱导效应。划痕实验中M-SBWE处理（125 μg/mL）在24和48 h后细胞迁移有限或无迁移，伤口间隙基本不变。显微镜检查显示处理细胞维持正常形态和附着，确认缺乏迁移非因细胞毒性。这些特性可能有益于皮肤保护或抗衰老应用而非直接组织再生。4.1 构效关系。4.1.1 协同抗氧化机制——M-SBWE的强抗氧化活性（IC??=2 μg/mL）归因于其独特的κ和ι-卡拉胶组成，超过
U. lactuca的ulvan（IC??=3 mg/mL）和
A. nodosum的fucoidan（IC??=30 μg/mL）。3,6-脱水半乳糖残基和硫酸酯增强向自由基的电子供给。高总酚和黄酮含量是主要贡献者。硫酸化多糖特别是卡拉胶的硫酸基可有效清除超氧阴离子。4.1.2 抗菌和抗生物膜作用——观察到的剂量依赖性抗菌和抗生物膜效应与NMR鉴定的卡拉胶结构特征密切相关。卡拉胶的阴离子特性使其能够与细菌细胞表面和膜蛋白的正电荷残基发生静电相互作用，破坏膜完整性。高分子量聚合物（平均约305 kDa）可在细菌表面形成物理屏障，抑制营养摄取并防止初始细菌黏附。4.1.3 免疫调节/免疫刺激效应——M-SBWE的双重免疫调节行为是其分子组成的直接结果。在RAW264.7巨噬细胞中刺激NO产生是某些高分子量多糖的特征，可被免疫细胞模式识别受体识别， priming免疫系统。4.1.4 免疫警觉而不增强迁移——HaCaT角质形成细胞中TNF-α基因表达显著上调而无TGF-β1 concomitant增加或细胞迁移增强，揭示了特定分离的生物活性谱。4.1.5 所提机制的局限性——本节提出的机制为假设性的，未在本研究中直接测试。结论部分：本研究确认减小起始生物质粒径可增强多种绿色提取方法从
M. japonica中提取生物活性化合物的效率。在测试方案中，SBWE结合25–53 μm粒径组分获得最高生物活性化合物回收。此外，本研究首次证明新制备提取物的抗菌、免疫调节和细胞相容性特性。结构表征显示提取物由高分子量硫酸化卡拉胶（平均Mw约305 kDa，主要为κ-和ι-）和酚类化合物组成。这些发现表明观察到的生物活性与这些组分的联合存在相关。然而，各组分的确切贡献和协同相互作用的潜力需要通过分级、各卡拉胶类型定量和组合测试进一步研究。
M. japonica提取物富含宝贵生物活性化合物，表明其作为改善肠道健康的营养保健品配方活性成分的潜在应用。进一步的体内研究应在相关肠道炎症或感染动物模型中评估M-SBWE的安全性、生物利用度和功效。
