《Hematology, Transfusion and Cell Therapy》：Impact of pre-treatment with melatonin on hematological alterations and splenic lipid peroxidation in phenylhydrazine-induced acute hemolytic anemia in Wistar rats
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溶血性贫血（hemolytic anemias）以红细胞（red blood cells）的过早破坏为特征，导致机体氧化还原失衡（redox imbalance）。在此条件下，脾脏（spleen）等器官可能受到特别影响。褪黑素（melatonin）以其抗炎和抗
溶血性贫血（hemolytic anemias）以红细胞（red blood cells）的过早破坏为特征，导致机体氧化还原失衡（redox imbalance）。在此条件下，脾脏（spleen）等器官可能受到特别影响。褪黑素（melatonin）以其抗炎和抗氧化特性而闻名，已成为一种有前景的治疗候选物。因此，本研究探讨了褪黑素预处理对接受苯肼（phenylhydrazine, PHZ）诱导急性溶血性贫血的雄性Wistar大鼠的影响。研究人员将28只雄性Wistar大鼠随机分配至四个实验组：对照组（control）、贫血未治疗组（anemic and untreated）、非贫血褪黑素治疗组（non-anemic treated with melatonin）和贫血褪黑素治疗组（anemic treated with melatonin）。血液学分析使用全血样本进行，而脾脏组织用于氧化应激的生化评估和形态学分析（morphometric analyses）。结果显示，硫代巴比妥酸反应物质（thiobarbituric acid-reactive substances, TBARS）与血红蛋白（hemoglobin）水平之间呈负相关（r = ?0.8406; p < 0.0001）。溶血还诱导了抗氧化反调节反应（antioxidant counterregulatory response），表现为硫醇（thiol）水平升高（p = 0.0005）。此外，巯基（sulfhydryl）水平与硫代巴比妥酸反应物质水平呈正相关（r = 0.8108; p < 0.0001）。然而，褪黑素未能恢复贫血动物的血液学参数，也未能阻止脾脏脂质过氧化（lipid peroxidation）的增加。结论认为，脾脏组织对溶血诱导的氧化损伤表现出抗氧化反应，脂质过氧化与贫血严重程度相关。然而，在所测试的条件下，褪黑素在减轻急性溶血性贫血相关的氧化应激或血液学改变方面无效。
研究背景：贫血是一组以红细胞计数减少为特征的疾病，表现为血红蛋白和血细胞比容水平下降，常伴有红细胞形态改变。全球约30%的人口患有某种类型的贫血，是重要的全球公共卫生问题。溶血性贫血以红细胞的早期和严重破坏为特征，其平均生理寿命约为120天。溶血过程可发生在血管内，也可在脾脏中发生血管外溶血。遗传性改变是先天性贫血的主要原因，如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD）缺乏症。G6PD缺乏导致烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）生成减少，使红细胞对氧化应激更为敏感。实验性PHZ模型可刺激氧化过程，产生与G6PD缺乏症相似特征的细胞环境。在溶血性贫血背景下，血红素和铁浓度可能增加，导致脾脏组织中活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生增加。脾脏红 pulp 通过网状内皮巨噬细胞系统负责选择和清除衰老或结构改变的红细胞。然而，文献中探讨褪黑素在溶血性贫血条件下对脾脏抗氧化潜力及其对脾功能影响的数据有限。褪黑素是松果体合成的主要激素，也在胃肠道、皮肤和线粒体等松果体外位点产生，以其强大的抗氧化和抗炎特性著称。因此，本研究通过评估血液学参数和氧化应激标志物，探讨褪黑素在PHZ诱导急性溶血性贫血雄性Wistar大鼠脾脏中的抗氧化作用。
研究方法：研究使用来自南里奥格兰德联邦大学（UFRGS）实验动物繁殖与实验中心（CREAL）的28只21日龄、体重约45 g的雄性Wistar大鼠（Rattus norvegicus）。动物饲养于同校基础健康科学研究所（ICBS）药理学系动物设施中，温度22 °C（± 2 °C），12小时光暗循环，相对湿度40%–60%，自由获取水和食物。实验开始前进行14天适应期。所有程序遵循南里奥格兰德州动物保护法典、国家动物实验控制委员会（CONCEA）指南和国际医学科学组织理事会（CIOMS）国际动物生物医学研究指导原则。项目经UFRGS动物使用伦理委员会（CEUA）批准（批准函No 45.707）。样本量计算使用Microsoft Excel，参数为误差概率α = 0.05和统计功效（1 ? β）= 0.80，基于实验氧化应激数据获得所需统计参数，计算所需样本量为22只动物，考虑实验模型固有死亡率增加25%，最终样本量为28只，随机分为四组：对照组（CTRL, n = 7）、贫血组（PHZ, n = 7）、褪黑素组（MEL, n = 7）和褪黑素+贫血组（MEL+PHZ, n = 7）。褪黑素以20 mg/kg剂量经口灌胃预处理14天，随后通过腹腔注射最多两剂PHZ（每剂40 mg/kg）诱导急性溶血性贫血，间隔24小时。褪黑素和PHZ分别使用10%二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）溶液和蒸馏水作为载体，对照组仅接受载体。最后一次腹腔注射后24小时根据CONCEA安乐死指南处死动物。血液收集于含乙二胺四乙酸抗凝剂的试管中用于血液学分析，制备血涂片进行May-Grunwald-Giemsa染色，定性评估红系和白系细胞。脾脏处死后立即收集称重，用0.9%氯化钠溶液洗涤，与血清一起储存于?20 °C直至生化分析。通过血红蛋白、间接胆红素水平及红细胞形态、多染性、有核红细胞、Howell–Jolly小体和网织红细胞增多评估实验性溶血性贫血建立情况。最终21只动物用于统计分析（CTRL: n = 5; PHZ: n = 5; MEL: n = 6; MEL+PHZ: n = 5）。
主要技术方法：研究采用雄性Wistar大鼠PHZ诱导急性溶血性贫血模型，通过口灌胃给予褪黑素（20 mg/kg，14天）进行预处理；血液学分析使用全血样本通过自动化血液分析仪检测红细胞系列参数和白细胞计数及分类；网织红细胞计数采用亮甲酚蓝染色法手工计数；总胆红素和间接胆红素采用重氮化反应法测定；脾脏指数通过脾重/体重比计算；脾组织匀浆后采用Lowry法进行总蛋白定量；亚硝酸盐采用Griess比色法测定；总ROS采用DCFH-DA氧化法测定；巯基采用DTNB比色法测定；脂质过氧化采用TBARS法测定；统计分析使用GraphPad Prism 8.0.2进行Shapiro–Wilk正态性检验、单因素方差分析及Bonferroni事后检验、双因素方差分析和Pearson相关性分析。
研究结果：
血液学分析证实苯肼诱导溶血性贫血模型的建立：血液学分析显示PHZ和MEL+PHZ组血红蛋白和红细胞值较CTRL和MEL组显著降低（p < 0.0001）；RDW和网织红细胞值在PHZ和MEL+PHZ组较CTRL和MEL组升高（p < 0.05）；MCV在各组间无差异，但PHZ和MEL+PHZ组MCH值较对照组升高（p < 0.05）；总胆红素和间接胆红素在PHZ和MEL+PHZ组显著高于CTRL和MEL组（p < 0.05）；总白细胞计数在PHZ和MEL+PHZ组较CTRL和MEL组增加（p < 0.05）；分叶核中性粒细胞计数在PHZ和MEL+PHZ组较CTRL组增加约12倍。褪黑素对所评估的血液学参数无显著影响。
血涂片观察到的血液学改变——溶血性贫血的证据：CTRL和MEL组红细胞呈正细胞正色素性特征，外周血网织红细胞数量少；PHZ和MEL+PHZ组红细胞数量减少，伴有明显红细胞大小不均、多染性和网织红细胞增多，并可见Howell–Jolly小体。
脾脏形态学分析：PHZ和MEL+PHZ组脾脏重量和大小较CTRL和MEL组显著增加（p < 0.0005），但PHZ和MEL+PHZ组间无显著差异。
褪黑素预处理对脾脏氧化损伤的影响：PHZ和MEL+PHZ组亚硝酸盐和巯基水平较CTRL和MEL组升高；ROS水平在PHZ和MEL+PHZ组较CTRL和MEL组降低（p < 0.05）；脂质过氧化（TBARS）水平在PHZ和MEL+PHZ组较CTRL和MEL组升高（p < 0.05）。相关性分析显示巯基水平与TBARS水平呈正相关（r = 0.8108; p < 0.0001）。
脾脏脂质过氧化对血液学指标的潜在影响：血红蛋白水平与脂质过氧化之间呈显著负相关（r = ?0.8406; p < 0.0001）。
讨论部分总结：本研究旨在探讨急性溶血性贫血对脾脏氧化应激的影响，并研究褪黑素预处理是否可作为抗脂质过氧化的保护因素。本研究中急性溶血性贫血与网织红细胞增多、白细胞增多、TBARS水平升高及脾脏组织非酶抗氧化反调节反应（硫醇水平升高）相关，数据提示溶血与脂质过氧化之间存在关联。然而，在本实验条件下（剂量和疗程），褪黑素未减轻急性溶血性贫血诱导的氧化应激或血液学改变。结果提示接受PHZ的组别（PHZ和MEL+PHZ）存在与溶血性贫血相符的改变，血涂片微观分析观察到红细胞大小不均、多染性、血小板聚集、Howell–Jolly小体、鬼影红细胞和细胞碎片等特征性发现，外周血网织红细胞增多可能提示骨髓对溶血的高反应性。MCH值升高也可能与溶血性贫血中常见的网织红细胞计数增加有关。总胆红素和间接胆红素升高提示大量溶血。总白细胞和中性粒细胞计数增加似乎与溶血性贫血诱导的炎症反应相关。脾脏作为次级淋巴器官，在识别衰老或缺陷血细胞方面高度特化。本研究中急性溶血性贫血促进PHZ和MEL+PHZ组动物脾脏肥大，脾肿大伴有PHZ治疗动物脾脏呈暗红色，与溶血性贫血的病理生理模式一致。褪黑素似乎未逆转过度溶血引起的脾脏充血，PHZ和MEL+PHZ组间无显著差异。脾脏红 pulp 巨噬细胞负责处理和清除红细胞降解过程中释放的血红素和铁，这些溶血产物可能破坏氧化还原稳态并促进氧化应激。当前结果显示PHZ和MEL+PHZ组脾脏氧化损伤标志物如脂质过氧化增加，相反巯基和一氧化氮水平在两组中显著升高，提示对急性溶血性贫血诱导的氧化应激的潜在反调节反应，这可能解释这些组中观察到的ROS水平降低。褪黑素似乎不直接干扰这些氧化应激参数。然而，褪黑素及其代谢物已知通过清除自由基发挥抗氧化作用，降低ROS生物利用度和氧化应激，还可与MT1和MT2受体相互作用激活调节核因子红细胞2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2）等转录因子的细胞内信号通路，促进抗氧化酶合成。既往研究表明褪黑素在溶血性贫血中具有潜在保护作用，2006年Erat & Ciftci报道对红细胞谷胱甘肽还原酶活性有积极影响，2005年Piriyakhuntorn等证明接受褪黑素（20 mg/天，一年）的地中海贫血患者脂质过氧化水平降低。贫血模型（褪黑素给药剂量和疗程）的差异可能解释当前发现与文献报道之间的差异。研究局限性包括：溶血性贫血判定方案使用间接胆红素和血红蛋白浓度，但其他更特异的方法如血浆血红素、乳酸脱氢酶或结合珠蛋白可供使用；研究可受益于评估不同剂量和疗程褪黑素给药的实验设计；抗氧化酶活性评估可提供额外信息；炎症通路分析将加强研究；口服褪黑素给药后生物利用度评估可为未来研究提供有价值信息。
研究结论翻译：在本研究中，PHZ诱导的Wistar大鼠急性溶血性贫血与显著血液学损害、脾肿大、脾脏脂质过氧化增加及硫醇和亚硝酸盐水平升高相关。然而，20 mg/kg褪黑素预处理14天未改善这些改变。这些发现受限于研究所用褪黑素和PHZ干预的具体实验方案条件。因此，未来研究应探索该溶血性贫血模型中褪黑素治疗的不同剂量、治疗方案和机制终点。
