小鼠内侧背侧丘脑核团吻侧部表达VGLUT2与Drd2神经元的全脑投射图谱

《IBRO Neuroscience Reports》：Brain-wide projections of VGLUT2- and Drd2-expressing neurons in the rostral part of the mediodorsal thalamic nucleus of the mouse

　　

啮齿类动物的内侧背侧丘脑核团（mediodorsal thalamic nucleus, MD）包括内侧段（medial segment, MDm）、中央段（central segment, MDc）与外侧段（lateral segment, MDl）。此外，在小鼠中MD还存在一个吻侧突起，占据MD整个吻尾轴延伸的吻侧约25%，并沿用"MD"之称。谷氨酸囊泡转运体2（vesicular glutamate transporter 2, VGLUT2）与多巴胺受体D2亚型（dopamine receptor subtype 2, Drd2）分别由VGLUT2/SLC17A6与Drd2基因编码，选择性表达于MD的两群神经元（以下分别称MD^VGLUT2或MD^Drd2神经元）。研究人员在VGLUT2-Cre与Drd2-Cre小鼠中分别以腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体稀疏标记位于MD吻侧突起的40个MD^VGLUT2与13个MD^Drd2神经元，对其进行重构并配准至Allen小鼠脑共同坐标框架（Allen Mouse Brain Common Coordinate Framework, CCFv3）。单个神经元各自投射至多个脑区，MD^VGLUT2与MD^Drd2神经元群的投射区域数目分别介于2~23与3~19之间。大多数MD^VGLUT2与MD^Drd2神经元与纹状体苍白球结构及腹内侧前额叶皮层（ventromedial prefrontal cortex, vmPFC）均存在紧密连接。皮层下结构包括尾壳核（caudoputamen, CP）与伏隔核（nucleus accumbens, ACB）以及前嗅核（anterior olfactory nucleus, AON）接受最频繁的支配与最多的轴突终末。苍白球结构如终纹床核（bed nuclei of the stria terminalis, BST）与无名质（substantia innominata, SI），以及嗅结节（olfactory tubercle, OT）与丘脑网状核（reticular nucleus of the thalamus, RT）亦受到频繁支配。在所有投射至皮层的MD^VGLUT2与MD^Drd2神经元中，约77%（37/48）表现出紧密的MD-vmPFC连接，且其中多数为基质型（matrix type）神经元，其特征为轴突终末分布于皮层第1~3层（L1-3）。MD^VGLUT2与MD^Drd2神经元投射组（projectome）的神经元间投射组差异性分别区分出6个MD^VGLUT2与2个MD^Drd2神经元亚群（聚类）。综上，本研究数据揭示了一种紧密的MD-vmPFC连接模式，该模式与MDm皮层投射的拓扑结构高度相似，而与MDc或MDl者不同。因此，"MD"最吻侧部分极可能是MDm的延续。总体而言，MD^VGLUT2或MD^Drd2神经元整合入特定、分离但相互依存的MD亚网络，包括PFC-纹状体苍白球-MD-PFC环路，从而在情绪与认知相关行为调控中发挥重要作用。

研究背景方面，啮齿类动物内侧背侧丘脑核团（MD）依细胞构筑与/或连接分为内侧段（MDm）、中央段（MDc）与外侧段（MDl），各段通过差异性的输入-输出连接分别主要服务内脏-边缘、嗅觉或注意信息处理功能，此种功能分工根源于MD神经元类型在形态测量、电生理特性、基因组学及输入-输出连接等方面的异质性。MD神经元可经选择性连接组成分离和/或相互依存的网络，如皮层-丘脑-皮层环路与皮层-基底神经节-丘脑皮层环路。然而既往几乎所有关于MD的知识均来自对MD三段的研究，而解剖学上MD尚存在单一吻侧突起，在小鼠脑图谱中被称为"MD"，占据MD吻尾轴吻侧约25%（大鼠更少），该部位受到的关注甚少，其与MD三段的关系鲜有研究。所有MD神经元无论遗传背景如何均可依据囊泡谷氨酸转运体（VGLUT）1、2或其共表达进行分组，而VGLUT2可能在MD中占优势。鉴于MD表达Drd2，且表达Drd2的神经元是MD-额叶-纹状体环路的重要组成部分，该环路中多巴胺稳态破坏可致认知障碍（如精神分裂症与帕金森病），研究人员以吻侧"MD"为研究对象，旨在：（1）在单神经元分辨率解析表达VGLUT2与Drd2的MD神经元（MD^VGLUT2与MD^Drd2神经元）的全脑连接；（2）从神经元投射组角度探讨吻侧"MD"与不同MD段的关系。传统示踪技术（如荧光金、麦胚凝集素-辣根过氧化物酶）或群体标记虽产出有洞见的输入-输出连接数据，但与解析基因定义神经元类型的连接不相容，且在小尺寸结构中用病毒进行基因标记类型特异神经元群体标记时示踪剂扩散限制难以控制；近来稀疏病毒标记结合三维神经元重构在表征单个类型特异神经元精细结构方面表现卓越，使单个神经元精准定位至小尺寸"MD"成为可行。

研究人员开展了以下研究：对吻侧"MD"的MD^VGLUT2与MD^Drd2单神经元进行三维重构与形态测量分析，共分析精准定位于吻侧"MD"、标记与重构质量高的40个MD^VGLUT2与13个MD^Drd2神经元。结论为：吻侧"MD"内表达VGLUT2或Drd2基因的单个神经元以轴突侧支投射至多个脑区，主要包括纹状体苍白球结构与vmPFC（如PL、ILA与ORBm）；这些神经元向纹状体苍白球结构（如CP、ACB与BST）的输出可能整合入丘脑-PFC-纹状体-丘脑环路，在执行功能中发挥协调与同步作用；MD-vmPFC连接一贯出现于MD^VGLUT2与MD^Drd2神经元的丘脑皮层投射中，且该连接恰好体现MDm-PFC连接的拓扑结构；因此就丘脑皮层连接而言，吻侧"MD"与MDm高度亲和而非与MDc或MDl亲和，按Franklin与Paxinos（2007）小鼠图谱所定义的吻侧"MD"在解剖学上是MDm超出MDc与MDl吻侧边界的吻侧延伸。其重要意义在于：MD^VGLUT2或MD^Drd2神经元整合入特定、分离但相互依存的MD亚网络（包括PFC-纹状体苍白球-MD-PFC环路），从而在情绪与认知相关行为调控中发挥重要作用。

关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员采用稀疏病毒标记结合荧光显微光学切片断层成像（fluorescence micro-optical sectioning tomography, fMOST）获取全脑双通道图像，经Fast Neurite Tracer（FNT）软件进行单神经元三维追踪与质量控制评分，将重构神经元经Advanced Normalization Tools（ANTs）线性与非线性配准转化至Allen小鼠脑共同坐标框架（CCFv3）标准空间，并以无监督聚类（Ward连接法，基于轴突终末数自然对数转换后的欧氏距离）对投射组相似神经元分群；样本为6只成年VGLUT2-Cre与3只Drd2-cre小鼠，另用3只Drd2-cre×Ai14杂交小鼠以荧光原位杂交（FISH）验证Drd2身份（97.93±0.50%的tdTomato神经元同时表达Drd2 mRNA）。

研究结果方面：3.1 MD^VGLUT2神经元的投射组——通过无监督聚类将40个MD^VGLUT2神经元分为6个亚群（C1~C6）：C1与C2主要投射至vmPFC（PL、ILA、ORBm与ORBv），C1另强烈投射至CP与ACB；C3主要连接前扣带皮层（ACA），偶见投射至CP；C4~C6为与纹状体（特别是CP与ACB）紧密连接的分组，其中C5存在至vmPFC的中等投射而区别于几乎无或极弱皮层投射的C4/C6，C4与C6则以致AmyC.输入相区分。亚皮层结构中CP与ACB接受较重投射，BST与SI等苍白球结构接受相对较弱投射，另可见至AmyC.（BLA、BMA和/或MEA）及嗅系统（OT、AON）的中等轴突投射，RT亦为MD^VGLUT2神经元频繁靶向的主要结构。3.2 MD^Drd2神经元的投射组——无监督层次聚类将13个MD^Drd2神经元分为2个亚群：Cluster 1除至AON的重投射外主要连接纹状体苍白球系统（CP、ACB、OT、SI）；Cluster 2主要重投射至vmPFC并另有至纹状体苍白球结构（CP、ACB、BST）的侧支投射，其强烈的皮层投射使之区别于Cluster 1；不少MD^Drd2神经元亦频繁投射至RT。总之，与MD^VGLUT2神经元相似，MD^Drd2神经元与纹状体苍白球系统（特别是CP、ACB、BST）及vmPFC紧密连接，且两群神经元均与AON有强连接。3.3 轴突终末的切向与层状分布——通过分析轴突终末与各PFC亚区不同皮层的对应关系，53个MD^VGLUT2/MD^Drd2神经元中5个仅投射至皮层下区而无皮层投射，其余48个（36个MD^VGLUT2与12个MD^Drd2）具皮层连接；48个皮层投射神经元中约90%（43/48）将轴突终末分布于一个或多个PFC亚区（主要为ACA、PL、ILA、ORB与AI），其中33/36个MD^VGLUT2与10/12个MD^Drd2皮层投射神经元投射至PFC，PFC亚区分别接受MD^VGLUT2与MD^Drd2神经元全部皮层终末的约84%（3009/3556）与约98%（1097/1125）；43个MD^VGLUT2/MD^Drd2神经元中40个（31个MD^VGLUT2与9个MD^Drd2）投射至MDm皮层代表区（vmPFC、ACAv和/或AId），vmPFC为最频繁靶区。依核心-基质-板内（core-matrix-intralaminar）分类框架，43个PFC投射神经元中30个属基质型，提供两群神经元PFC相关终末总和的约99%（4048/4106），其余13个板内型（IL）神经元仅占约1%（58/4106）；由于啮齿类PFC缺乏显著L4或仅有 rudimentary L4，无神经元符合核心型定义；仅2个神经元（#a26与#f30，约占基质型神经元的7%）在ACAd（接受MDl投射的PFC亚区）有重度终末分布。

讨论部分总结与结论翻译：研究人员首次对吻侧"MD"的MD^VGLUT2与MD^Drd2单神经元进行三维重构与形态测量分析，发现每个神经元连接一组投射区，两群神经元按轴突靶区均可分为两大类：一类将轴突导向皮层下（主要为纹状体）结构而皮层投射缺失或极弱，另一类（亦为主要部分）投射至皮层（特别是PFC）并同时具有强度不等的丘脑纹状体苍白球与丘脑杏仁核投射；至纹状体CP与ACB的投射构成突出的MD-皮层下连接，而MD^VGLUT2/MD^Drd2-vmPFC（PL、ILA和/或ORBm）连接为最突出投射，与MDm投射的皮层代表区一致。讨论指出，MD^VGLUT2与MD^Drd2神经元群代表MD兴奋性神经元下相对特异的从属类别，两者在皮层下与皮层连接上的高度组间相似性可能提示MD^VGLUT2上级与MD^Drd2下级神经元群之间的层级关系；单神经元水平的研究证实了MD与RT、杏仁核复合体、纹状体苍白球系统及PFC之间存在相互投射的经典认识，MD^VGLUT2/MD^Drd2-PL/ILA连接可能参与内脏-边缘生理并承担情绪驱动，vmPFC/纹状体苍白球连接可能功能性地贡献于锥体外系系统，且MD^Drd2神经元可能在决策中面对任务不确定性时经去抑制PL内表达血管活性肠肽（VIP）的GABA能神经元而增强PFC活动；单神经元经轴突侧支连接一组投射区可协调和/或同步多区不同神经元群体活动，并可更好解释顺行示踪所见的MD传出标记多野并发。关于层状模式，30个基质型神经元弥散投射至多个宽广皮层区、终末主要分布于L1-L3及L5-L6，可招募更多皮层神经元群实现跨脑区神经活动的同步与协调，L5与L6锥体神经元向丘脑核团（含MD）发出前馈（驱动）与反馈（调制）输入、后者再投射回皮层，从而形成经丘脑途径调制皮层-皮层信息流的机制；13个IL型神经元投射至PFC亚区L5-6及纹状体，但其在PFC内终末仅约1%，其皮层加工中的生理作用可能可忽略；MD以基质神经元为主、仅散在核心神经元，IL型神经元出现于MD并不意外，尤其吻侧"MD"与板内核组成部分旁中央核在腹外侧相邻，部分IL型神经元可能混入并共存于吻侧"MD"。关于吻侧"MD"与MD段的关系，MD各段皮层代表区呈拓扑排列（MDm投射至vmPFC、AId与ACAv，MDl投射至dmPFC或PL/ACAd/MOs背侧部，MDc投射至AIv/ORBl），这些皮层拓扑尤以MDm者在系统发生上一定程度保守；本研究观察到显著而一致的MD^VGLUT2/MDDrd2-vmPFC（PL、ILA与ORBm）通路，提示其输出与啮齿类MDm皮层连接高度亲和而非与MDc、MDl者亲和，偶见的AId/ACAv投射亦为MDm投射特征，而典型代表MDc与MDl拓扑的AIv/ORBl与ACAd投射则弱得多；近期研究显示仅MDl而非MDm中可检出支配接受MDl投射皮层区（dmPFC）VIP阳性神经元的Drd2阳性神经元，为MD^Drd2-vmPFC连接重现MDm-vmPFC连接模式提供间接支持。结论翻译：吻侧"MD"内表达VGLUT2或Drd2基因的单个神经元以轴突侧支投射至多个脑区，主要包括纹状体苍白球结构与vmPFC（如PL、ILA与ORBm）；这些神经元向纹状体苍白球结构（如CP、ACB与BST）的输出可能整合入丘脑-PFC-纹状体-丘脑环路，在执行功能中发挥协调与同步作用；MD-vmPFC连接一贯出现于MD^VGLUT2与MD^Drd2神经元的丘脑皮层投射中，且该连接恰好体现MDm-PFC连接的拓扑结构；因此，就丘脑皮层投射而言，吻侧"MD"与MDm高度亲和而非与MDc或MDl亲和；据此从丘脑皮层连接角度可合理推断，Franklin与Paxinos（2007）小鼠图谱所定义的吻侧"MD"在解剖学上是MDm超出MDc与MDl吻侧边界的吻侧延伸。