双翅目昆虫授粉对银胶菊（*Parthenium argentatum* Gray）植株发育、代谢产物积累及生殖生物学的影响

《Industrial Crops and Products》：Pollination of guayule ( Parthenium argentatum Gray) by Diptera: Effects on plant development, metabolite production, and reproductive biology

　　

银胶菊（*Parthenium argentatum* Gray）原产于北美南部干旱地区，为菊科（Asteraceae）植物，兼具无融合生殖（apomixis）与有性生殖能力，存在从二倍体至五倍体的倍型变异。直播（direct seeding）是该作物最具经济可行性的建植方式，但倍型异质性与种子产量偏低严重制约其作为天然橡胶替代来源的产业化。授粉（pollination）对种子结实率具有关键作用，但既往研究多聚焦于生殖输出，授粉对植株生理、生物量分配及次级代谢的调控作用尚不清楚。本研究在西班牙Castilla-La Mancha地区地中海气候条件下，首次评估商业化管理双翅目（Diptera）授粉昆虫在银胶菊栽培中的应用潜力。研究采用完全随机设计，设4个授粉处理：自由授粉（free pollination, FP）、*Sphaerophoria rueppellii*授粉（SP）、*Lucilia sericata*授粉（LP）及无授粉（no pollination, NP），于温室与露地条件下测定植株发育进程、种子产量、生物量积累、次级代谢产物（树脂、橡胶及guayulins A–D）含量及种子萌发能力。结果表明，授粉处理显著影响植株物候发育，授粉植株弱株比例降低、开花株比例升高；种子产量未受授粉显著影响，可能与兼性无融合生殖（facultative apomixis）提供的生殖保障有关；萌发率虽未达统计显著水平，但效应量较大，LP处理种子萌发率呈最高趋势；橡胶、树脂及guayulins含量主要受组织类型与发育阶段调控，授粉处理无显著效应；自由授粉处理干生物量较低，但该处理与温室处理环境条件存在差异，解释需谨慎。研究提示，双翅目授粉对银胶菊的潜在益处更多体现在种子性能与植株发育而非种子数量，授粉昆虫种类可能塑造部分响应，授粉管理可作为银胶菊种子生产与建植阶段的补充策略。

银胶菊（*Parthenium argentatum* Gray）是原产于北美南部干旱区的菊科（Asteraceae）植物，可在同一花中产生有性与无性种子，为兼性无融合生殖（facultative apomixis）物种，且存在从二倍体到五倍体的倍型变异及种质内倍型异质性。直播（direct seeding）是建立银胶菊作物最具经济可行性的方式，但固有的倍型异质性与不完善的种子生产体系严重制约其作为天然橡胶替代作物的产业化，因此亟需能够大量生产优质、均一种子的稳健方法，而种子低萌发率使苗床授粉尤为关键。既往研究表明风媒与虫媒授粉均显著影响种子结实率，蜜蜂（*Apis mellifera*）为高效授粉者，但相关研究主要集中于生殖输出，授粉对植株生理、生物量分配与次级代谢的调控作用在其他作物中已有积累证据，在银胶菊中却鲜有涉及。基于前期在西班牙Castilla-La Mancha地区银胶菊田间发现双翅目（Diptera）昆虫丰度较高的结果，研究人员在温室受控条件下比较了*Sphaerophoria rueppellii*授粉（SP）、*Lucilia sericata*授粉（LP）、自由授粉（free pollination, FP）与无授粉（no pollination, NP）对银胶菊种子生产、生物量积累、次级代谢产物合成及种子萌发能力的影响，假设双翅目授粉可相对于自由授粉与无授粉处理影响生殖表现、植株发育、生物量积累与次级代谢产物组成。

研究所用银胶菊种质为AZ-5（USDA种质库），采用完全随机设计，设4个授粉处理，每个密闭授粉处理分配3个隧道式温室作为3个独立重复，另设3个露地小区作为自由授粉处理的3个独立重复。每个温室移栽120株3.5月龄、高10 cm的幼苗，行内株距15 cm、行距25 cm，温室以防蓟马网（16×10 wires cm?1）完全封闭，地面铺设防草网，安装滴灌系统；露地小区植株数量与种植布局相同但不覆盖，允许自然授粉。温室内温度用数据记录仪每10 min采集一次，较环境温度平均高2.5–3.5 °C。试验于2023年6月23日开始，持续4周：FP处理允许自然授粉；SP处理按供应商推荐每两周释放一次*S. rueppellii*，密度25头 m?2，每次于离地100 cm处悬挂两个含100蛹的盒子（接收至孵化期间维持15–18 °C），共释放两次（6月23日与7月7日）；LP处理按供应商规格每周悬挂两个含蛹的塑料盒，释放量200 ml（25 ml m?2，约3300蛹）；NP处理温室内不释放昆虫并每日检查清除入侵者。两种昆虫的释放频率与密度未标准化，旨在评估商业推荐管理实践下的授粉表现。灌溉方面，5月至7月依据生育阶段与降水每两周灌水270 mm，计入降雨后总计供水851.5 mm；试验结束前一周停止灌溉以促进种子成熟并防止新花出现，期间于5个日期（06/23、06/27、07/03、07/10、07/17）监测植株成熟阶段。试验于7月21日结束，用剪刀仔细去除所有未开放花蕾，于7个日期（07/19至08/04）逐花手工采收成熟种子，称量raw seed重量后清选获得clean seed重量。用于萌发率评估的种子采收后在牛皮纸袋中于20 °C、相对湿度<40%的黑暗凉爽干燥环境贮藏9个月以减轻休眠影响，每个采样日期各温室内不同植株的种子混合为温室水平代表性样本，不同采样日期样本保持独立，试验前充分混匀并随机取25粒种子作为每个重复（n=75）；种子置于浸泡滤纸上，折叠装袋保持湿度，于22 °C黑暗控温生长箱中培养，6天后重新浸湿滤纸并评估6天萌发率，12天后进行最终评估，每个温室重复3次。生物量方面，10月18日手工采收除末行外全部植株，离地10 cm剪断后称鲜重并装袋，60 °C烘箱干燥48 h至含水量12%（以卤素灯水分分析仪于105 °C测定，180 s内失重<0.1%视为恒重），干燥后称重；采收前每温室选取6株代表性植株进行个体测量（株高、株宽、鲜重）与代谢物分析。干燥后计算全株生物量，手工去除叶与花，茎与叶分别切碎并经2 mm锤式研磨机与0.5 mm离心研磨机两步研磨，干燥研磨样品于螺口玻璃容器中室温黑暗保存1周后进行傅里叶变换近红外光谱（Fourier transform near infrared spectroscopy, FT-NIR）分析。代谢物测定采用Perkin Elmer Spectrum One FT-NIR仪（Norwalk, CT, USA）配近红外反射附件，约2 g干燥研磨样品置于3 cm直径石英样品板，按García-Martínez et al.（2022）方法于750–2500 nm波长范围、16 cm?1分辨率采集数据，所有样品扫描两次；树脂、橡胶及guayulins A、B含量采用García-Martínez et al.（2022）的校准模型，guayulins C、D因NIR设备按色谱峰面积校准，采用Agilent ChemStation软件（version B.03.01）以guayulin C标准曲线（1.25–2000 mg L?1，r2=0.9985，LoD=0.085 mg L?1，LoQ=0.283 mg L?1）与guayulin D标准曲线（1.25–2000 mg L?1，r2=0.9997，LoD=0.089 mg L?1，LoQ=0.298 mg L?1）定量，guayulin标准品因缺乏商品化标准由实验室自行分离。数据分析采用IBM SPSS Statistics v30，以混合线性模型（mixed linear models）分析，依据各试验的层次与/或纵向性质适配协方差结构；重复测量试验（植株物候与种子生产）将采样时间、授粉处理及其交互作用设为固定效应，采样时间设为重复因子，比较Identity、CS、AR(1)、CSH等协方差结构并选择AIC拟合与估计稳定性最佳者，当异质复合对称（CSH）结构改善拟合且不扭曲边际均值时采用为最终模型，CSH产生不稳定估计时改用自回归AR(1)结构；两层抽样单元（温室与植株）的层次设计（生物量生产、植株子集分析、代谢物生产与萌发）将授粉处理设为固定效应并指定含截距的嵌套随机效应。自由度采用Kenward–Roger法估计，多重比较采用?idák校正，效应量以偏eta方（partial eta squared, ηp2）表示并按Cohen（1988）标准解释（0.01、0.06、0.14分别代表小、中、大效应），结果以估计边际均值及95%置信区间（95% CI）上限呈现，显著性水平α=0.05；模型假设通过残差图（正态性与方差齐性）及随机效应检验，因拟合模型数量多，以补充图S1为代表示例。物候类别（死亡、弱株、发育良好、开花）互斥且完备，其百分比属成分数据，故分别作为预设描述性物候响应分析。

结果与讨论部分，模型假设检验未发现偏离正态性、异方差或其他系统性模式的迹象（补充图S1），Pearson残差Q–Q图紧贴参考线，残差对拟合值图呈随机散布，无漏斗形、方差增大或曲率等模式。3.1 植株发育：混合线性模型显示授粉处理与采样时间对植株成熟有显著效应，二者交互作用不显著（表1）；dead、weak、good development、flowering四类物候的授粉效应分别为F(3,8)=7.648, p=0.010；F(3,8)=17.754, p<0.001；F(3,8)=3.054, p=0.094；F(3,8)=27.517, p<0.001，采样效应分别为F(4,18)=1.325, p=0.298；F(4,17)=44.611, p<0.001；F(4,16)=58.998, p<0.001；F(4,15)=169.546, p<0.001，交互效应分别为F(12,20)=0.479, p=0.904；F(12,18)=2.258, p=0.056；F(12,17)=1.598, p=0.182；F(12,17)=2.196, p=0.068。死亡株百分比在整个采样期保持恒定，其他物候阶段随时间变化：弱株百分比随每次采样显著下降，至S5最低；发育良好株比例从S1至S3显著下降后保持相对稳定；开花株从S1至S4显著增加后在S4与S5间稳定，表明植株随生长季推进由营养发育逐渐过渡到生殖阶段，与地中海夏季条件下银胶菊预期物候一致；效应量分析显示采样日期对弱株（0.913）、发育良好株（0.938）与开花株（0.978）均为大效应。授粉处理亦显著影响物候阶段分布（图3b）：自由授粉温室死亡株百分比显著高于*L. sericata*处理，无授粉与*S. rueppellii*处理与两者均无显著差异，但各处理死亡率均较低，对整体作物表现影响可能有限；无授粉处理弱株比例最高、开花株比例最低，而所有可接触授粉者的处理表现相似；发育良好株比例在各授粉处理间无显著差异；授粉效应对死亡株（0.745）、弱株（0.872）与开花株（0.912）均为大效应。这些结果提示授粉者存在与植株生理及生殖状态呈正相关，授粉植株倾向于维持较低弱株比例与较高开花株比例；菊科既往授粉排除实验已证明授粉者可得性可显著影响生殖输出、种子生产与种子质量，但对营养活力的直接影响关注较少。涉及自由授粉处理的差异解释需谨慎，因露地与温室处理不仅授粉制度不同，环境条件亦不同，部分响应可能反映授粉与生长环境的综合效应，自由授粉下较高死亡率可能部分受环境暴露影响；授粉者存在与植株发育关系的生物学基础尚不确定，但物候状态差异提示授粉者可得性可能影响进入生殖阶段的植株比例。3.2 种子生产：对raw seed与clean seed，混合线性模型均显示采样显著效应，仅raw seed的采样与授粉交互作用显著（表2）：raw seed与clean seed的授粉效应分别为F(3,9)=2.969, p=0.092与F(3,8)=2.326, p=0.149，采样效应分别为F(6,20)=12.645, p<0.001与F(6,20)=10.660, p<0.001，交互效应分别为F(18,23)=2.108, p=0.047与F(18,23)=1.754, p=0.101。raw seed产量随采收期逐渐下降，至最后采样（S6–S7）最低，clean seed产量呈类似趋势，自S5起下降尤为明显，表明种子生产随夏季推进而减少，较早采收可能最大化种子产量，此模式与地中海夏季环境胁迫加剧一致，也与银胶菊最热月份种子表现下降的既往观察相符；效应量分析显示采样日期对raw seed（0.793）与clean seed（0.760）均为大效应。Pollination×Sampling交互效应量亦较大（raw seed 0.625，clean seed 0.575），表明处理效应随时间变化明显；raw seed生产在最后采收（S6与S7）时交互作用最明显，此时总种子产量已显著下降，无授粉植株raw seed产量趋于高于授粉植株，但clean seed生产未见此模式，提示raw seed产量差异未必转化为更高产量的可育清选种子，故将这一响应解释为生殖投入的适应性增加需谨慎；虽可能植株在授粉者限制下产生比例更多的保护组织，但本研究未直接评估该假设。授粉对种子生产影响有限可由兼性无融合生殖解释，该机制在银胶菊中早有记载，使授粉机会有限时仍能形成种子，被视为该物种生殖保障的重要来源，可解释授粉者排除下种子生产得以维持；尽管本研究未直接量化无融合生殖，非授粉植株维持种子生产的能力与银胶菊生殖生物学一致，AZ-5等多倍体基因型主要以兼性无融合生殖繁殖，可能促成即使昆虫授粉减少或缺失时仍观察到相对较高的萌发率。温室与露地处理比较需谨慎解释，自由授粉植株暴露于降雨、风及更大温度变异性等不同于温室的环境条件，FP与温室处理间差异可能反映授粉制度与生长环境的综合影响，既往研究亦表明蜜蜂授粉可改善银胶菊种子生产与质量，但季节性环境条件同样强烈影响生殖表现。3.3 生物量生产：混合线性模型显示授粉仅对温室干生物量有显著效应（F(3,8)=6.595, p=0.015），对鲜生物量无显著效应（F(3,8)=2.948, p=0.098）。自由授粉植株干生物量低于无授粉与*Sphaerophoria*授粉处理，*Lucilia*授粉下生物量呈中间值；效应量分析显示干生物量大效应（0.712），表明授粉处理解释了干物质积累变异的相当比例。仅干生物量检出显著差异反映植株生理的潜在差异，提示授粉处理可能影响组织组成而非总植株质量，但机制尚不确定；一种可能解释是某些处理促进结构化合物更多积累，导致干物质增加而鲜生物量未相应增加；虽本研究未直接测定木质化，木质素是植物干生物量的主要组分，其积累通常随组织成熟与次生细胞壁发育而增加，木质素沉积或其他结构碳水化合物的差异可能促成所观察模式，但需进一步解剖或生化分析验证。生物量授粉效应的解释还应结合物候结果，授粉处理尤其是*Sphaerophoria*处理开花株比例较高、弱株比例低于授粉者排除处理，提示授粉者存在与植株生理状态正相关，但授粉处理与生物量积累关联的机制仍不清楚；与对生殖表现的明确效应相比，授粉对营养生长的直接效应在文献中关注有限。涉及自由授粉处理的比较需谨慎，露地与温室条件在多个环境因子上不同，自由授粉下较低干生物量可能反映授粉制度与栽培环境的综合效应，露地栽培相关环境胁迫可能独立于授粉者活动而降低干物质积累。虽本研究无法确定响应的直接机制，结果提示授粉者存在连同有利生长条件可能有助于改善作物表现，授粉管理可作为在保持银胶菊低投入特性的同时提升生产系统生产力的补充策略。3.4 温室子样本表征：与温室水平结果相反，在个体植株水平分析时，授粉处理对株高（F(3,8)=1.906, p=0.207）、鲜生物量（F(3,68)=1.031, p=0.385）与干生物量（F(3,8)=2.048, p=0.186）均无显著影响，表明尽管温室尺度干生物量存在差异，授粉未在个体银胶菊植株间产生一致的营养生长变化；缺乏统计显著性提示个体植株间变异较大，可能降低检出处理差异的能力。这些模式提示植株生长响应与授粉处理并不一致，可能反映生殖过程与营养发育间复杂互作；温室水平干生物量显著效应与个体水平不显著的对比可能表明处理效应在群体尺度显现，而非通过个体植株生长变化实现，分布于许多个体的开花状态、植株活力、存活或生物量积累的微小差异可共同影响温室总生产力而不产生个体水平统计可检出的变化。这些发现表明银胶菊营养生长受多种互作因子塑造，并非单独对授粉处理均匀响应；授粉者存在与开花及植株发育状态差异相关，但在本研究所评估条件下其对个体植株生长与生物量积累的影响似乎有限。3.5 FT-NIR代谢物测定：授粉与植物次级代谢的互作已被广泛记载，次级代谢物在植物–授粉者互作中发挥重要作用，影响授粉者行为、花部吸引力与生殖过程，授粉本身亦被视为植物资源分配与化学组成变化的潜在驱动因素。本研究中授粉处理未显著影响代谢物积累（图7）：叶片中树脂（F(3,8)=0.294, p=0.829）、橡胶（F(3,8)=0.854, p=0.503）、guayulin B（F(3,8)=0.370, p=0.777）、guayulin C（F(3,8)=0.766, p=0.545）、guayulin D（F(3,8)=0.568, p=0.651）均无显著效应；茎中树脂（F(3,8)=0.213, p=0.885）、橡胶（F(3,8)=0.175, p=0.911）、guayulin B（F(3,8)=0.245, p=0.863）、guayulin C（F(3,68)=0.692, p=0.560）、guayulin D（F(3,8)=1.999, p=0.193）亦无显著效应；guayulin A因多数观测值为零未分析。这些结果表明本研究所评估的生殖处理在该发育阶段未产生可检出的代谢物积累变化，虽观察到一些处理特异性趋势，但均不能直接归因于授粉。相比之下，植物组织间差异显著：树脂浓度在茎与叶中相似，与Mahmood（1987）观察一致；橡胶积累叶高于茎，此结果出乎预期，因银胶菊通常被视为茎产橡胶物种，可能表明幼株中橡胶合成最初发生于叶片而后转运至茎；guayulin组成在组织间差异明显，成熟植株中通常作为主要guayulin的guayulin A几乎缺失，而guayulins C与D在叶中比例更高、guayulin B在茎中更高，这些模式可能与植株幼龄发育阶段有关，既往研究提示guayulin D可能作为其他guayulins的前体且这些化合物分布随植株发育与转运过程变化，故所观察代谢谱可能反映组织特异性积累模式尚未达到成熟植株特征特征的早期发育阶段。为进一步评估株龄与发育阶段是否影响次级代谢物积累，一年后对全部实验温室植株的代谢物组成进行分析（图8），评估两组：（i）各温室最后一行未采收而保留的植株（non-harvested plants）与（ii）10月18日采收后再生长的植株（regrown plants）；期间维持温室管理条件包括灌溉制度且未再引入授粉者，故此随访评估旨在评估与株龄及再生历史相关的代谢物模式，而非对授粉效应提供独立检验。与授粉无显著效应相反，组织身份在代谢物积累中起主要作用（图8）：未采收植株中组织显著影响树脂（F(1,10)=93.910, p<0.001）、guayulin A（F(1,10)=423.175, p<0.001）、guayulin B（F(1,10)=18.354, p=0.002）、guayulin C（F(1,10)=135.752, p<0.001）、guayulin D（F(1,10)=128.859, p<0.001）浓度，效应量显示样品来源（叶或茎）解释了树脂（0.904）、guayulin A（0.977）、guayulin B（0.647）、guayulin C（0.931）、guayulin D（0.928）变异的很大比例；再生植株中组织显著影响树脂（F(1,10)=195.036, p<0.001）、橡胶（F(1,10)=195.036, p<0.001）、guayulin C（F(1,10)=68.865, p<0.001）、guayulin D（F(1,10)=37.628, p<0.001）浓度，效应量分别为树脂（0.951）、橡胶（0.841）、guayulin C（0.873）、guayulin D（0.790）。这些发现强化了幼株中已观察到的组织特异性模式，表明银胶菊次级代谢存在强区室化；结果提示发育阶段不仅影响次级代谢物丰度，也影响其在植株内的空间分布，叶与茎间代谢物分配随植株成熟而日益分化。值得注意的是，橡胶浓度在未采收与再生植株间极为相似，且始终趋于茎高于叶（图8b），提示橡胶积累在采收后迅速重建，可能相对独立于植株采收历史；但需注意银胶菊橡胶代谢研究多集中于成熟植株与茎组织，对幼株与叶片信息相对匮乏，所观察模式可能反映发育效应，一种可能解释是幼株中橡胶合成最初在叶中较活跃，随后随植株成熟逐渐转运并积累于茎，虽本研究未直接评估生物合成活性或转运过程，所观察模式的一致性支持该假设，研究组正在进行的研究亦观察到类似趋势。Guayulin谱显示更清晰的组织特异性模式（图8c）：未采收植株中guayulins A与B主要积累于叶，而guayulins C与D始终在茎中更丰富；再生植株中guayulins A与B几乎缺失，因大量零值无法统计分析，提示这些化合物的生物合成或积累可能需要采收后更长发育期，在幼嫩再生组织中不能快速恢复。再生植株中guayulins A与B近乎缺失从生理角度尤为有趣：若这些化合物如既往所提出发挥防御作用，其产生似乎并非由机械损伤立即诱导，其积累可能依赖发育阶段或组织成熟度；相比之下guayulins C与D在未采收与再生植株中浓度相当，提示其合成在刈割后迅速恢复，这与Rozalén et al.（2021）提出的guayulin D可能作为其他guayulins前体、guayulins C与D可能构成guayulin代谢中储库化合物的假设一致；guayulin A丰度极低连同guayulins A/B与C/D在叶与茎间的对比分布可能是植株幼龄的结果，guayulins C与D可能在早期发育阶段优先合成并随组织成熟转化为或关联于guayulins A与B的积累，再生植株中guayulins A与B几乎完全缺失进一步支持这些化合物在采收后需要更长建立期的观点。另一观察是再生植株茎中guayulins C与D浓度趋于与未采收植株相当甚至更高，而叶中浓度相对相似；虽本研究数据无法直接推断代谢通量，该模式与采收后guayulins C与D持续合成及这些化合物可能向茎组织转运相符；相比之下guayulins A与B未见类似恢复，可能支持采收促进guayulins C与D持续合成但未必促使其随后转化为guayulins A与B的假设，至少在幼株中如此；在此背景下，如Rozalén et al.（2021）最初所提出，guayulins C与D可能不仅是guayulin家族的储库，还可能参与银胶菊更广泛的倍半萜相关代谢途径。本文报道的分布模式得到既往描述组织特异性积累及guayulin化合物间协调关系研究的进一步支持，银胶菊相关分析提示存在不同的guayulin组（A/C与B/D）以及异戊二烯代谢内协调关联，支持guayulin生产高度组织化与受调控而非在组织间随机分布的观点。虽这些趋势连同既往发表研究与本研究组正在进行的工作支持guayulin代谢组织化的假设，仍需结合代谢组学、基因表达分析、同位素示踪与发育研究验证这些机制。总体而言，代谢物结果表明银胶菊次级代谢受组织身份与发育阶段的影响强于授粉处理；叶与茎间显著差异连同guayulins A–B与C–D的对比分布支持guayulin途径内存在高度结构化且动态的代谢组织；这些组织特异性模式在较老植株中更为明显，提示代谢物区室化随植株成熟而增强；虽授粉处理未对代谢物积累产生统计显著效应，其他物种中记载的次级代谢与植物–授粉者互作关系表明不能排除间接效应，值得进一步研究。生物量、形态与代谢物数据的解释还应考虑所采用采样策略：生物量生产在温室水平评估，而代谢物组成与植株形态采用每温室6株代表性植株子集评估，故这些结果应视为平均植株响应的代表而非处理内变异的完整表征；未来研究纳入更大且完全随机化的样本将增强生理与代谢分析的稳健性并促进群体与植株水平响应的整合。3.6 萌发率：授粉处理对播种后6天（F(3,17)=2.998, p=0.059）或12天（F(3,12)=3.211, p=0.061）萌发百分比均无显著影响，但两项分析均接近常规显著性阈值，尤其6天时提示存在处理相关趋势；效应量估计表明授粉处理对6天（0.341）与12天（0.438）萌发表现均有相当贡献，提示尽管统计支持有限，处理间可能存在生物学意义差异；p值与效应量间的不一致可能反映萌发响应的高生物变异与可用于分析的实验单元数量有限的综合作用，虽种子在各温室内混合并随机取子样本以捕获采样日期与母株间变异，每重复种子数相对较少可能降低统计功效；此外虽种子在受控条件下贮藏9个月以减轻休眠效应，但未直接评估种子活力、休眠状态或种子大小变异，这些因素可能增加未解释变异并掩盖授粉处理间可能存在的有意义的差异。尽管如此，各授粉处理间观察到一致趋势：无授粉处理种子萌发百分比趋于较低，而*L. sericata*授粉下生产的种子一般显示最高萌发率（图9）；Mahmood（1987）报道蜜蜂授粉植株种子萌发百分比显著高于授粉者排除植株，而本研究中仅检出非显著趋势与大效应量，尽管统计结果不同，两项研究均指向昆虫介导授粉对银胶菊种子质量的潜在正效应，但授粉者身份、实验设计、种质、环境条件与种子处理程序的差异限制直接比较。授粉可能影响种子发育过程如胚形成、种子充实或生理种子质量，从而改善萌发表现，但本研究未纳入种子活力、胚发育或种子生理质量的直接测定，无法详细评估相关机制。银胶菊生殖生物学亦有助于解释这些结果：如3.2节所述，银胶菊已知表现兼性无融合生殖，允许通过有性与无融合生殖的不同组合产生种子；虽无融合生殖可缓解授粉者排除对种子产量的影响，但未必意味着种子质量相当，未授粉植株较低萌发率提示即使种子生产得以维持，授粉仍可能对种子产量有正贡献。虽观察到的萌发差异未达统计显著，一致的处理趋势与大效应量提示授粉可能影响种子性能，需进一步研究确定授粉者介导的种子质量改善能否转化为田间建植成功率的提高。综合而言，这些发现凸显授粉者在银胶菊栽培中的重要性，其影响可能超出种子生产延伸至与作物建植、植株发育及整体生产力相关的性状。这些响应的机制未被直接研究但可能为多因素：除改善受精成功率外，授粉可能通过花粉介导信号影响生殖与营养生长间资源分配并改变发育轨迹；此外银胶菊的兼性无融合生殖特性为所观察模式提供合理解释，虽无融合生殖可确保无授粉者时种子生产，但既往研究表明有性产生的种子常表现更高萌发与后代性能，授粉亦可能通过假受精过程与改善胚乳形成增强生殖发育；这些机制与本研究结果一致，即非授粉植株产生大量种子而授粉处理一般产生萌发率更高、后代更有活力的种子。从农业角度看，授粉处理趋于显示更高萌发率与更有活力的植株发育，干生物量积累检出显著差异，这些结果提示授粉可能影响商业推荐管理条件下与作物建植及生产力相关的性状，但需进一步研究确认这些响应在不同生产条件下的稳定性；这些效应可能促成植株间更大均匀性，便于作物建植与管理，对育种计划与开发更一致的银胶菊生产系统尤为重要；因此授粉管理可成为未来银胶菊生产的重要组成部分，尤其在种子生产与作物建植阶段，可靠的授粉服务可能有助于降低生殖成功率的变异性并改善种子源种植材料的质量与性能。所观察响应可能具有值得进一步研究的潜在农艺与经济意义：虽橡胶浓度未受授粉处理显著影响，授粉植株观察到的更高生物量生产可能转化为单位面积更高生物量产量；鉴于天然橡胶从植物生物量中获取，生物量生产增加可能有助于提高田间尺度橡胶产量，从而改善银胶菊作为天然橡胶替代可持续来源的经济可行性。更广泛而言，本研究结果有助于日益认识到双翅目作为有价值农业授粉者的作用，结果提示双翅目物种可在受控条件下提供有效授粉，可能成为综合授粉管理策略的有用组成部分；然而对于大规模露地栽培，商业化管理蜜蜂目前可能因已有成熟管理实践及在广泛栽培区域部署蜂群的可能性而提供更大后勤可行性，前提是环境条件支持足够觅食活动；研究人员强调双翅目与蜜蜂的潜在互补性而非将其视为替代授粉者，管理授粉者的多样化不仅可增强授粉可靠性，还可增强银胶菊生产系统的可持续性与稳定性，尤其在干旱与半干旱地区典型的环境挑战条件下。解释这些发现时应考虑若干局限：*S. rueppellii*与*L. sericata*释放率不同，因遵循商业推荐而非标准化密度，处理效应可能部分反映授粉者可得性差异，但所采用的释放策略反映真实商业实践，为寻求在温室作物中实施替代授粉系统的种植者提供直接相关信息；此外自由授粉处理在露地条件下进行而其余处理在温室进行，环境差异亦可能促成所观察响应，此类条件可影响授粉者活动与授粉成功，露地小区昆虫亦可自由在周围植被上觅食而非仅限银胶菊植株，不同于引入温室的 Managed 授粉者，故自由授粉与温室植株间差异可能反映授粉与生长条件的综合影响而非仅授粉效应，归因于授粉的效应应在此环境差异背景下解释；未来在等效生长条件下比较授粉处理的研究将有助于区分授粉者活动与环境因素对银胶菊表现的相对贡献。

讨论与结论部分，本研究提示授粉影响银胶菊表现的若干关键方面，但其效应具有性状依赖性与情境特异性。授粉处理未显著改变总种子产量，对生物量积累影响不一致；相比之下授粉者处理与植株发育及开花差异相关，萌发分析显示一致的处理趋势与大效应量但缺乏统计显著性；授粉处理对次级代谢物积累几乎无可检出效应，后者主要受组织身份与植株发育状态影响。综合而言，这些发现提示授粉对银胶菊的潜在益处可能更多与种子性能及植株发育相关而非仅种子数量；此外观察到的授粉者处理间差异表明授粉者身份可能参与塑造其中部分响应。然而这些效应应结合不同实验条件解释，因自由授粉处理在露地条件下进行而其余处理维持于密闭温室，部分观察差异可能反映授粉制度与环境条件的综合影响而非仅授粉效应。据研究人员所知，这是首个评估商业化管理双翅目授粉者在地中海栽培条件下用于银胶菊的研究，结果提供初步证据表明授粉者活动可能影响与作物建植及表现相关的性状，但需在更受控实验条件下进一步研究以区分授粉效应与环境影响并阐明潜在生理、生殖与生化机制；未来研究还应考虑野生蜜蜂在Castilla-La Mancha特定条件下授粉的作用。