21q22.3新候选位点与孤立性肠旋转不良的关联鉴定

《Human Molecular Genetics》：Identification of a novel candidate locus at 21q22.3 for isolated intestinal Malrotation

　　

肠旋转不良（IM）是胚胎发育过程中旋转异常所致的一种相对常见的胃肠道先天畸形。部分IM病例为综合征表现的一部分，但大多数为孤立性，其遗传学基础在很大程度上仍不明确。研究人员报告了一个近亲阿拉伯贝都因家系中呈明显常染色体隐性遗传的孤立性IM家系病例。共招募来自两个核心家庭的9名个体。利用单核苷酸多态性（SNP）芯片数据进行纯合性定位和优势对数（LOD）值计算。分析全外显子组和全基因组测序数据以识别候选变异。应用多种分析和解读工具评估并描述潜在的疾病相关变异。纯合性定位在染色体21q22.3上识别出一个2 Mb的候选位点。多点连锁分析在染色体21上识别出一个重叠位点（最大LOD值：3.168）。对PCNT基因中的一个错义变异（Gln1951Pro）以及其他若干共分离候选变异进行了评估。研究结果证明染色体21q22.3上存在一个与孤立性IM相关的新候选位点，PCNT成为潜在的候选基因。需要纳入更多患病家系开展进一步研究并进行功能验证，以确立该位点及所识别变异在孤立性IM发病机制中的作用。

肠旋转不良（intestinal malrotation，IM）是胚胎发育过程中肠管旋转异常所致的一种相对常见的消化道先天畸形。部分IM病例为综合征表现的一部分，但大多数为孤立性，其遗传学基础在很大程度上仍不明确。已有研究报道家族性IM存在多种遗传方式，提示其具有显著但多样的遗传成分，然而迄今尚未鉴定出与孤立性IM相关的疾病位点或基因。基于此，研究人员对一个近亲阿拉伯贝都因家系中呈明显常染色体隐性遗传的孤立性IM家系开展了遗传学研究，旨在识别与孤立性IM相关的疾病位点及潜在候选基因。研究共招募来自两个核心家庭的9名个体，利用单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）芯片数据进行纯合性定位和优势对数（logarithm of odds，LOD）值计算，并对全外显子组测序（whole-exome sequencing，WES）和全基因组测序（whole-genome sequencing，WGS）数据进行分析以识别候选变异，应用多种分析和解读工具评估潜在疾病相关变异。研究结论为：染色体21q22.3上存在一个与孤立性IM相关的新候选位点，PCNT为潜在候选基因；但需纳入更多患病家系并开展功能验证，以确立该位点及所识别变异在孤立性IM发病机制中的作用。该研究为孤立性IM的遗传学基础提供了新的证据，并指出了进一步研究的方向。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：对来自两个核心家庭的9名个体进行临床评估、招募及外周血DNA提取；采用Illumina Omni Express BeadChip平台（涵盖超过750 000个SNP位点）进行SNP芯片分析，并使用HomozygosityMapper进行纯合性定位、Superlink在线软件计算全基因组LOD值；对每个分支各一名患病个体进行WES（HiSeq 2500）和WGS（NovaSeq 6000）测序，读段比对、变异检出和注释分别由BWA、GATK和SnpEff完成；使用Genoox的Franklin软件、CADD工具、PhyloP评分及内部VARista平台进行变异过滤与解读；使用Manta软件识别结构变异，并与内部数据库和GnomAD SVs数据库比对；采用Sanger测序验证PCNT变异的共分离，并使用Clustal Omega进行进化保守性分析。样本队列来源为阿拉伯贝都因裔近亲家系，研究经Soroka医学中心机构审查委员会批准（批准号5071G）。

研究结果如下：

临床特征：患病个体IV-3于胎龄35⁺2周出生，出生后2天因肠梗阻检查，造影灌肠正常、直肠活检正常，23天时因静止性呕吐诊断小肠梗阻，探查性Ladd手术中发现IM，肠环宽大、距回盲瓣35 cm。患病个体IV-5为IV-3之弟，胎龄39周出生，11天时因每次喂食后呕吐就诊，上消化道造影及急诊剖腹探查发现180度肠扭转及IM，无肠缺血证据。患病个体V-2来自该贝都因部落另一分支，胎龄36周出生，6天时因休克、血便、腹胀及压痛入院，上消化道造影及急诊剖腹探查发现IM及720度肠扭转，累及一段缺血肠管。所有病例确诊后均行Ladd手术，恢复顺利，出院时均实现完全经口喂养。

连锁分析：纯合性定位识别出两个纯合位点，其一为染色体21长臂上约2 Mbp的位点（21q22.3，rs2838588-rs117164191，21:44557228–46665705，hg38基因组版本），包含KRTAP10-3至KRTAP10-12、KRTAP12-1至KRTAP12-4、TSPEAR、UBE2G2、SUMO3、PTTG1IP、ITGB2、SLX9、ADARB1、POFUT2、COL18A1、SLC19A1、PCBP3、COL6A1、COL6A2、FTCD、SPATC1L、LSS、MCM3AP、YBEY、C21orf58、PCNT、DIP2A、S100B和PRMT2等蛋白编码基因；其二为染色体4上约650 Kbp的较短位点（4q34.2-4q34.3，rs4690696-rs13112548，4:176393646–177052908），仅含VEGFC一个蛋白编码基因。全基因组多点LOD值计算显示染色体21上约1.4 Mb的位点与纯合性定位所识别位点重叠（rs915876-rs2245760，21:43956326–45376207），最大LOD值为3.168。

变异过滤：Franklin平台分析下一代测序（next generation sequencing，NGS）数据共识别28个变异，其中13个被归类为批次效应或在内部数据库健康对照中呈纯合状态；剩余变异中13个CADD评分≤10而被排除，余下2个变异进一步研究。第一个为PCNT基因错义变异Gln1951Pro（HGVS：NC_000021.9:g.46411925A > C），CADD评分22.4，PhyloP评分2.057（在哺乳动物中保守）。第二个为KRTAP10-11基因错义变异Ser172Pro（HGVS：NC_000021.9:g.44646972 T > C），CADD评分16.59，PhyloP评分0.051；由于KRTAP10-11整个基因位于TSPEAR基因的一个内含子内，该变异同时为TSPEAR的内含子变异，且该变异在许多哺乳动物中不保守、该基因几乎仅在皮肤中表达，故优先级较低。最终识别出PCNT基因中一个潜在致病变异。WGS数据结构性变异分析共识别37个变异，其中29个由批次效应所致或为杂合；剩余8个中7个因内部数据库发现健康纯合个体而被排除，最后一个在GnomAD SVs数据库中亦发现健康纯合个体而被排除。

变异评估：对所有可用样本中PCNT变异周围区域进行测序，验证了其在家系中的共分离，符合隐性遗传模式。第1951位谷氨酰胺残基在哺乳动物中保守，从小鼠到人类均未改变。

讨论部分总结：研究人员报告了一个常染色体隐性孤立性IM家系病例，全基因组连锁分析识别出两个疾病相关位点，其中一个具有显著似然度；NGS数据分析发现PCNT基因中一个基于频率、进化保守性和预测工具具有致病潜力的候选变异。IM涵盖异质的解剖异常谱，可能通过不同的发育和遗传机制产生，因此研究结果应结合所研究的特定家系表型解读，而非作为所有孤立性IM共同遗传基础的证据。尽管三名患病个体临床表现和肠扭转程度不同，但同一大型近亲家系中该相对少见先天畸形的多例发生值得采用基于家系的遗传学方法研究；患病个体未表现出提示可识别综合征的额外临床表现，尤其无心血管、肺、神经或骨骼异常，但 underlying遗传综合征的可能性不能完全排除。尽管所有患病个体、而非任何未患病个体，对所查询的两个位点均为纯合，但最大LOD值仅对染色体21位点计算得出，故染色体4位点应视为初步发现，其与孤立性IM的关联尚未确认。鉴于所研究阿拉伯贝都因家系的高度近亲性，纯合性定位特别适合识别隐性疾病相关位点，但广泛近亲婚配也增加背景纯合性，可能通过增加识别与表型无关的共享纯合区域的可能性而降低该方法特异性；此外，位点或染色体长度及信息标记数量等技术因素可能影响连锁分析的分辨率。为减轻患病个体数量较少的限制，研究人员在遗传分析中纳入尽可能多的可用患病和未患病家庭成员，并交叉参照使用两个独立连锁/纯合性定位平台获得的结果；候选变异针对包含数百份样本（包括民族匹配个体）的内部数据库进行评估，以降低优先考虑同人群未患病个体中纯合变异可能性。然而这些互补方法不能完全克服小家系相关统计效力有限的问题，需在更多患病家系中进一步验证；独立患病个体队列的验证本可进一步加强研究结果，但因未获知任何其他适合复制结果的孤立性IM家系病例而不可行。最后，尽管使用短读长WGS数据进行结构变异分析，该方法敏感性并非绝对，某些类型结构变异可能未被检出。已有研究报道了包括IM在内的多器官表型综合征分子基础的若干见解：一种以肺泡毛细血管发育不良、肺静脉排列异常等为特征的综合征型IM由FOXF1基因截短突变所致，FOXF1调控中胚层衍生物，被认为在背侧肠系膜形成中起关键作用，而背侧肠系膜是确保肠道正常旋转的关键因素；另一种包括幽门狭窄、睾丸未降和中枢神经系统受累的综合征型与FLNA功能异常相关，FLNA编码调节细胞形状和迁移的肌动蛋白结合蛋白。IM还与若干左右轴模式化相关综合征相关，均累及胃肠道和心血管系统及其他器官，相关已知基因包括CFC1、ZIC3、NKX2-5、ACVR2B和LEFTY2，均在中胚层定向、TGF-β信号传导和左右轴模式化等发育过程中发挥作用；值得注意的是，除FLNA和ZIC3突变为X连锁隐性遗传外，上述基因均通过常染色体显性方式致病。有趣的是，位于染色体21q22.3候选区域内的ITGB2编码整合素β2，据报道与filamin A（FLNA）相互作用，而FLNA是一种与肠道发育和运动障碍相关的肌动蛋白结合蛋白。最后，对散发性综合征型IM的分析近期将其与若干罕见拷贝数变异相关联，其中一些位于既往与该病相关的位点内。非综合征型家族性IM罕见，仅有两例报道；与综合征表现一致，两例报道均描述常染色体显性遗传方式，但未进行遗传学分析；然而，已有常染色体隐性遗传的综合征型IM临床描述以及散发病例中观察到的若干染色体畸变发表。因此，所识别连锁位点和所讨论候选基因构成了对孤立性IM的首个遗传学见解。PCNT（Pericentrin）是中心体周围物质和中心体丝状基质的整合组分，在细胞分裂时微管组织初始组装中起关键作用；作为一种钙调蛋白结合蛋白，pericentrin与PCM1和DISC1相互作用并参与微管网络形成；因此，PCNT活性破坏导致有丝分裂纺锤体紊乱、染色体错分离及血清饥饿诱导的初级纤毛形成受阻；值得注意的是，PCNT通过与PKD2及鞭毛内运输蛋白（如IFT20）结合而被发现对初级纤毛形成至关重要。PCNT完全功能丧失在人类中的典型表现为小头骨发育不良原始侏儒症II型（microcephalic osteodysplastic primordial dwarfism type II，MOPD2），呈常染色体隐性遗传；该多器官发育综合征以宫内生长迟缓、严重矮身材和小头畸形为特征，其他症状包括咖啡牛奶斑、烟雾病或其他脑血管异常及冠状动脉发育不良；重要的是，绝大多数已报道的致病变异导致PCNT完全功能丧失（如引入终止密码子、移码插入缺失等）。表型差异的一种可能解释是所识别错义变异可能保留部分PCNT功能，可能导致较轻表型；然而未进行功能研究评估Gln1951Pro对PCNT活性的影响，其潜在亚效等位基因性质仍属推测。与PCNT相关的其他综合征包括Seckel综合征和Majewski III型，症状部分重叠；有趣的是，已有Majewski综合征伴IM的病例报道。值得注意的是，患病个体表型与PCNT相关综合征的经典多系统表现显著不同，这种表型差异提示在解读所识别PCNT变异与孤立性肠旋转不良潜在关联时需谨慎。有趣的是，Gaitanidis等在染色体17p13关联研究中突出的基因之一YWHAE也参与细胞周期和细胞骨架调控，提示与PCNT可能存在功能重叠，尽管二者之间尚未建立直接分子相互作用。尽管PCNT在中心体和纤毛功能中的既定作用以及既往将相关发育障碍与肠旋转不良相关联的报道为其参与提供了生物学合理性，但该证据仍为间接，不能确立PCNT在孤立性IM中的因果作用。左右轴模式化缺陷由多种分子机制引起，其中一个突出机制是初级纤毛功能受损；与此一致，原发性纤毛运动障碍的遗传原因与内脏异位的原因重叠；值得注意的是，近期一篇报道描述了若干将PCNT与内脏异位相关联的突变。值得注意的是，在所识别两个疾病相关位点内的共38个蛋白编码基因中，仅PCNT参与初级纤毛形成和功能。尽管所识别PCNT变异的共分离模式、进化保守性和预测功能影响支持其候选地位，但在缺乏功能验证或在更多患病家系中复制的情况下，这些发现不能确立PCNT与孤立性IM之间的因果关系。孤立性IM是一种隐匿却相对常见的先天缺陷，具有严重、可能致命的并发症；因此，开发诊断手段并实现预防措施至关重要；破译其 underlying机制，或至少其遗传模式，可能有助于实现这一目标。总之，需要进一步研究以刻画该背景下的疾病相关位点，重点在于识别致病基因和特定IM相关SNP，以及证实PCNT在其发病机制中的参与。研究结论部分译为：肠旋转不良（IM）是胚胎发育过程中旋转异常所致的一种相对常见的胃肠道先天畸形。部分IM病例为综合征表现的一部分，但大多数为孤立性，其遗传学基础在很大程度上仍不明确。研究人员报告了一个近亲阿拉伯贝都因家系中呈明显常染色体隐性遗传的孤立性IM家系病例。共招募来自两个核心家庭的9名个体。利用SNP芯片数据进行纯合性定位和LOD值计算。分析全外显子组和全基因组测序数据以识别候选变异。应用多种分析和解读工具评估并描述潜在的疾病相关变异。纯合性定位在染色体21q22.3上识别出一个2 Mb的候选位点。多点连锁分析在染色体21上识别出一个重叠位点（最大LOD值：3.168）。对PCNT基因中的一个错义变异（Gln1951Pro）以及其他若干共分离候选变异进行了评估。研究结果证明染色体21q22.3上存在一个与孤立性IM相关的新候选位点，PCNT成为潜在的候选基因。需要纳入更多患病家系开展进一步研究并进行功能验证，以确立该位点及所识别变异在孤立性IM发病机制中的作用。