原料乳储奶罐环境模拟的体外多物种生物膜模型：基于五种分离株的构建与清洗效能验证

《International Dairy Journal》：In vitro multi-species biofilm model for mimicking the raw milk bulk tank environment

　　

持久存在于原料乳储奶罐中的多物种生物膜（multi-species biofilms）对乳品工业构成挑战，并可损害原料乳及后续乳制品质量。本研究通过基于流行率和表型特征从原料乳储奶罐环境筛选菌株，并模拟其最差生长条件，构建了基于5株分离株的体外（in vitro）多物种生物膜模型。对该合成多物种生物膜的表征揭示了群落内潜在的种间竞争。与环境接种物来源的原料乳生物膜进行比较分析显示，两类生物膜均表现出相似生长（约8 log₁₀ CFU cm^?2），且在模拟农场清洗方案后活细胞数降低超过6 log₁₀ CFU cm^?2，表明其对清洗的响应相似。本研究开发的体外模型可作为表征多物种生物膜生长以及评估和优化当前农场原位清洗（Cleaning-In-Place，CIP）与消毒工艺的平台。

研究背景与问题：原料乳因牧场环境多源污染而具有复杂微生物群，其可在原料乳储奶罐（raw milk bulk tank）表面形成多物种生物膜（multi-species biofilms，由两种及以上微生物共同形成的表面附着群落）。低温储存不能阻止假单胞菌等嗜冷菌成膜；胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPSs）形成保护性基质并限制清洗剂渗透，使生物膜细胞持续污染原料乳及乳制品并影响货架期。原位清洗（Cleaning-In-Place，CIP）可改善生物膜控制，但既有研究多集中于单物种生物膜，而自然生物膜多为多物种且耐受性更高，故需建立可重复、实用、可分析的多物种生物膜实验室模型。由于不存在通用模型，需从环境筛选代表菌株并模拟最差条件。该研究旨在构建标准化体外模型，表征种间互作，并与原料乳接种物形成的生物膜比较，为评估和优化农场CIP及消毒工艺提供平台，而非重现原料乳生物膜的全部微生物多样性。

研究开展与意义：研究人员采用自上而下选择策略，从新西兰牧场储奶罐环境筛选菌株，构建由5株分离株组成的合成微生物群落（synthetic microbial community），并在20 °C、72 h条件下于不锈钢表面形成多物种生物膜。研究结论是该模型生长约8 log₁₀ CFU cm^?2，对推荐清洗方案的响应与原料乳生物膜相似，可作为可重复平台用于CIP评估与优化；其意义在于将复杂环境生物膜转化为可控实验系统。

方法（≤250字）：样本来自新西兰Waikato地区五个以草饲为主的奶牛场（Farm A–E），2025年挤奶季（1–4月）采集储奶罐拭子；Farm A–C用于可培养细菌分离，A–E用于16S rRNA基因测序。采用自上而下策略，按蛋白水解、常温/低温生物膜形成及低温浮游生长综合评分筛选菌株；将七株组成21个五株组合，以改良点样法比较对四类抗菌处理的耐受，选最高评分组合；以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和全基因组测序平均核苷酸一致性（ANI）鉴定；在316L不锈钢片上以商业超高温灭菌（UHT）全乳、20 °C、72 h、初始约10⁴ CFU mL^?1培养单/多物种生物膜；提取EPSs并定量胞外DNA（eDNA）、蛋白、多糖，用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察；以65 °C酸清洗比较合成多物种生物膜与原料乳生物膜。

研究结果：
3.1 宏基因组信息（Metagenomic information）：通过16S rRNA基因测序分析储奶罐拭子（每样本55,337–1,053,996条reads），发现跨罐共享属构成核心微生物群，但其具体出现情况和相对丰度在各样本间变化较大。
3.2 代表性分离株选择（Selection of representative isolates）：从59属、212株可培养分离株中，发现七属43株在三个农场共现，并经16S rRNA基因测序确认在五个农场共现；经四类表型综合评分，每属选一株，21个五株组合中Group 19平均综合评分最高（9.22），含Bacillus、Kocuria、Pseudomonas、Staphylococcus和Stenotrophomonas。
3.3 分离株鉴定（Identification of selected isolates）：全基因组ANI将4株鉴定至种水平（>95%），Stenotrophomonas分离株为94.6%，命名为Bacillus mobilis、Kocuria carniphila、Pseudomonas glycinae、Staphylococcus haemolyticus和Stenotrophomonas sp.；生长曲线显示P. glycinae在10和13 °C生长率最高，B. mobilis和S. sp.在20 °C略高于P. glycinae，B. mobilis偏好高温，P. glycinae和S. sp.在37 °C以上不生长，K. carniphila在30 °C生长率最高且13–40 °C可生长。
3.4 合成多物种生物膜与单物种生物膜生长（Synthetic multi-species biofilm vs single-species biofilm growth）：多物种生物膜中P. glycinae和S. sp.各约占50%、合计超过99%，B. mobilis低于1%，K. carniphila和S. haemolyticus低于检测限；除P. glycinae外，其余4株在多物种生物膜中较其单物种生物膜显著降低。
3.5 EPSs产生（EPSs production）：多物种生物膜eDNA显著高于单物种生物膜；B. mobilis和P. glycinae单物种生物膜蛋白显著高于多物种生物膜；多糖在二者与多物种生物膜间无显著差异；K. carniphila、S. haemolyticus和S. sp.单物种生物膜的eDNA和蛋白低于检测限且多糖显著较低。
3.6 CLSM图像（CLSM image）：CLSM显示多物种生物膜及3个快生长单物种生物膜均形成生物膜；多物种生物膜表面多为单层细胞，局部呈多层，P. glycinae单物种生物膜具类似结构；B. mobilis细胞较大、分布稀疏并在气液界面聚集；63×下可见网络样结构，其他单物种生物膜亦可见。
3.7 体外系统与原料乳生物膜验证（Verification of in vitro system compared to raw milk biofilm）：72 h培养后，原料乳生物膜与合成多物种生物膜无显著差异，均约8 log₁₀ CFU cm^?2（分别为8.12和8.22）；65 °C酸清洗后原料乳生物膜完全去除，合成多物种生物膜9个重复中1个残留3.31 log₁₀ CFU cm^?2，其余低于检测限，二者存活细胞数无显著差异。

讨论总结：该模型目的并非复制原料乳生物膜全部多样性，而是建立可重复且一致的标准化体系，反映多数新西兰原料乳储奶罐场景及生物膜生长最差条件。20 °C用于模拟夏季储奶罐上部因日晒可能出现的最高表面温度，72 h对应法规允许的最长农场储存时间；但模型仅代表单次生物膜生长周期，未覆盖清洗失败后的残留与再生长。20 °C下K. carniphila和S. haemolyticus未在多物种生物膜中检出，原文将其与较低生长率和潜在竞争压力联系起来；P. glycinae的OD₆₀₀结果可能因低温下EPSs促进细胞聚集而被高估。静态微孔板系统具有较高通量，但不能真实模拟搅拌储奶罐的水动力条件。P. glycinae在多物种生物膜中未显著降低，原文提出可能与Pseudomonas属在共培养中通过运动和增强EPSs产生占据生态位有关。EPSs提取主要代表松散结合部分，蛋白可能包含吸附的乳蛋白而高估。eDNA升高可能与竞争导致细胞损伤裂解或应激响应有关；CLSM网络样结构可能为eDNA网络，也可能与不锈钢晶界和荧光染料的非特异作用有关，尚需确认。与原料乳生物膜相似的生长和清洗响应支持该体外模型的有效性，但所用清洗处理仅为简单比较筛选，未复现商业CIP的完整化学、热和机械作用；唯一清洗后存活的重复被鉴定为B. mobilis，原文提出其可能来源于芽孢，需进一步研究，并需在CIP设计中兼顾芽孢去除与能耗优化。

结论部分翻译：研究人员开发了一种体外多物种生物膜模型，作为纳入与新西兰奶牛场储奶罐相关选定微生物和环境特征的标准化实验平台。对微孔板内不锈钢片上多物种生物膜形成的表征揭示了潜在种间竞争。该体外多物种生物膜模型表现出与原料乳生物膜相似的生长（约8 log₁₀ CFU cm^?2）和对推荐清洗方案的响应模式。此外，该研究提供了一种能够产生可重复且一致多物种生物膜的体外模型，为未来CIP评估和优化奠定基础。后续研究应整合水动力条件，并对完整CIP过程进行更详细的分步评估，同时利用多目标优化在维持乳品生产严格卫生标准的同时降低水、能源和化学品消耗。