奥地利ESL牛奶冷藏储存中耐热Microbacterium spp.与芽孢形成菌残留及品质风险研究

《International Dairy Journal》：Microbacterium spp. is the predominant thermoduric microorganism during storage of ESL-milk

　　

在ESL（extended shelf life，扩展货架期）牛奶储存期间，Microbacterium spp.是占主导地位的耐热微生物（thermoduric microorganisms）。ESL牛奶在≤8 °C条件下可维持12–21天的品质，但耐热微生物可持续存在。诸如Microbacterium和Bacillus等耐热微生物能够存活。生产者特异性计数提示ESL牛奶中存在与工厂相关的污染来源。单一样品中B. cereus计数>3 log₁₀ CFU/mL提示超过货架期后存在风险。

C.L. Laguna Paredes等围绕奥地利ESL（extended shelf life，扩展货架期）牛奶冷藏储存期间的耐热残留菌群及品质风险开展研究。研究背景在于，牛奶营养丰富且富含蛋白质、脂肪、糖和水，是微生物生长的理想基质；原料乳在挤奶、储存和运输中易受污染。巴氏杀菌可灭活繁殖体微生物，UHT（ultra-high temperature，超高温）可消除芽孢，但耐热毒素及耐热菌残留仍构成风险。ESL牛奶通过微滤结合巴氏杀菌或高巴氏杀菌延长货架期至21天，但Microbacterium、Bacillus thermodurans等耐热菌常逃避常规检测，加工后污染及冷链管理亦影响品质。因此，研究人员评估奥地利五家乳企ESL牛奶在6 °C和9 °C储存下的微生物与感官品质，并进行分离株鉴定。

关键方法（≤250字）：样本为奥地利五家乳企（A–E）零售3.5%脂肪ESL牛奶共98份，A、D为大型厂商，B、C、E为区域中型厂商；A、C–E采用微滤后巴氏杀菌，B采用bactofugation（离心除菌）后巴氏杀菌。样本于购买日、第4天、第8天及货架末第12天分析，储存温度6 °C和9 °C。开展感官评价（DIN 10964）、冰点（ISO 5764）和过氧化物酶检测；微生物计数包括AMC（aerobic mesophilic count，需氧中温菌落数）、AnAMC（anaerobic mesophilic count，厌氧中温菌落数）、Pseudomonadaceae、Enterobacteriaceae、LAB（lactic acid bacteria，乳酸菌）及pBC（presumptive Bacillus cereus，疑似蜡样芽孢杆菌）；分离株经PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链反应）扩增16S rRNA（16S ribosomal RNA，16S核糖体RNA）并Sanger测序、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，基础局部比对搜索工具）比对，Bacillus spp.辅以API 50 CH和API 20 E确认；采用Welch t检验比较温度效应。

3.1 微生物分析（Microbiological analysis）：通过98份样本在6 °C和9 °C下的AMC、AnAMC及选择性计数发现，Pseudomonadaceae、Enterobacteriaceae和LAB全程低于1 log₁₀ CFU mL^?1。6 °C储存样品中81.6%为满意（<2.7 log₁₀ CFU mL^?1），18.4%为可接受（2.7–5.0 log₁₀ CFU mL^?1）；9 °C储存样品中60.2%满意、30.6%可接受、9.2%不满意（>5.0 log₁₀ CFU mL^?1）。货架末AMC范围为1.1 log₁₀ CFU mL^?1（生产者D，6 °C）至5.7 log₁₀ CFU mL^?1（生产者C，9 °C），生产者B总体最高、D最低。95.9%样品符合Regulation (EC) No 2073/2005对货架末巴氏乳AMC≤5.0 log₁₀ CFU mL^?1的要求；9 °C下4份样品超过6.0 log₁₀ CFU mL^?1（生产者B、C）。货架末生产者B（6 °C）和E（9 °C）的pBC分别为3.83和4.32 log₁₀ CFU mL^?1，其余<2.00 log₁₀ CFU mL^?1（检测限）。AMC与AnAMC间及6 °C与9 °C间均无显著差异（P>0.05）。

3.2 感官与化学分析（Sensory and chemical analysis）：通过感官五点量表、冰点和过氧化物酶检测发现，6 °C和9 °C储存样品气味满意率分别为79.6%和85.7%；6 °C样品自第4天出现变化，9 °C样品自第6天出现变化；6 °C样品轻微偏差为6.1%，9 °C为2.0%，主要气味为“陈旧”“干酪味”“ stale（ stale）”。味道满意率在9 °C为59.2%、6 °C为41.8%，差异表现为“陈旧”“苦味”“furry（毛糙感）”；生产者C劣变最高，B和E次之。微生物满意率与感官结果不完全一致；2 log₁₀ CFU mL^?1即可检测风味变化，而>5 log₁₀ CFU mL^?1未必对应明显风味变化。多数样品过氧化物酶阳性，提示短时巴氏杀菌，生产者D第二次采样提示高巴氏杀菌；冰点?0.503至?0.523 °C，密度约1.0334 g cm^?3，微滤未影响这些化学性质。原文提出氧化或耐热酶解可能参与6 °C感官劣变，但未测氧化产物或溶解氧，属待验证解释。

3.3 货架期末微生物群检测（Microbial detection of microbiota at the end of shelf-life）：通过168株分离株的16S rRNA测序和API确认发现，Actinomycetota占78.0%（131/168）、Bacillota占21.4%（36/168）、Pseudomonodota占0.6%（1/168）；科水平以Microbacteriaceae为主（70.2%，118/168），其次为Bacillaceae（10.1%）、Paenibacillaceae（4.8%）、Micrococcaceae（4.8%）和Staphylococcaceae（3%）。共鉴定21种，Microbacterium flavum占48.2%（81株），Microbacterium lacticum占21.4%（36株），Bacillus pumilus占6.0%，Bacillus mycoides占4.2%，Paenibacillus pabuli占4.2%，Micrococcus yunnanensis占3.0%。多数分离株属BSL（biosafety level，生物安全等级）1，Bacillus mycoides和Staphylococcus epidermidis属BSL 2。Microbacterium lacticum与“陈旧”“苦味”相关，M. flavum与“陈旧”“干酪味”相关，提示其缓慢肽酶和酯酶活性可导致低水平酶解腐败。Bacillus mycoides可在微滤膜和管道形成生物膜并释放芽孢和细胞，Bacillus pumilus见于生产者C和E，Paenibacillus pabuli为耐冷生物膜形成菌；Enterococcus durans和Streptococcus thermophilus呈生产者特异性，后者可在热交换器板片形成生物膜。

讨论部分总结：原文讨论认为，生产者间稳定差异提示工厂相关持续污染源或生物膜，而非随机批次污染；>5.0 log₁₀ CFU mL^?1常伴随不良风味、凝固及耐热脂肪酶/蛋白酶所致品质问题；pBC>3 log₁₀ CFU mL^?1提示超过货架期后毒素风险。感官劣变可在低菌数下发生，原文提出氧化反应或耐热酶解参与，但未测相关指标；Microbacterium spp.的非发酵性酶活更符合本研究的“陈旧”“苦味”“干酪味”缺陷。结论与展望部分（译述）：对来自奥地利五家乳企的98份商业ESL牛奶进行微生物学和感官分析，显示零售环节总体质量良好。货架末，以Microbacterium lacticum、M. flavum及Bacillus pumilus、B. mycoides和Paenibacillus spp.等芽孢形成菌为主的耐热残留菌群是质量限制因素，而6 °C与9 °C储存温度在所观察货架期内对微生物生长无显著影响。所有生产者ESL牛奶中均检出Microbacterium lacticum和M. flavum，提示Microbacteriaceae可能指示巴氏杀菌乳中的残留菌群；感官劣变与Microbacterium spp.缓慢肽酶和酯酶活性一致，而非经典嗜冷腐败。这些发现表明，巴氏杀菌后污染和耐热菌携带而非仅冷链滥用决定ESL牛奶货架期，ESL质量管理应常规考虑Microbacteriaceae；尽管采用微滤和巴氏杀菌，芽孢形成菌仍表现显著耐受性，需改进加工和卫生策略。Bacillus mycoides在微滤膜和管道形成生物膜可使芽孢和营养细胞持续进入产品流并绕过过滤屏障，其疏水性芽孢增强对不锈钢表面的黏附并耐标准CIP（cleaning in place，原位清洗）；Enterococcus durans和Streptococcus thermophilus等耐热菌具生产者特异性，存在在热交换器板片形成生物膜的风险。研究局限为样本购自零售，无法获得厂内加工参数和微滤后计数；未测氧化化学标志，限制了对9 °C储存感官优势的解释；分离株鉴定仅限货架期末。未来应结合厂内全链条采样（原料乳、微滤后、巴氏后、灌装）、化学腐败标志、耐热菌群基因组鉴定及新型节能清洗概念下生物膜和CIP效果监测。