基于原位中子成像定量解析膝关节软组织宏观水扩散特性

《Materialia》：Quantifying Macroscopic Water Diffusion in Knee Joint Tissues via in situ Neutron Imaging

　　

摘要专业翻译 膝关节中的负荷通过半月板和关节软骨传递，这两种组织是高度水合的软骨样组织，且存在大面积完全或部分无血管区域。组织内水的流动性对其承重能力和营养供应均至关重要。水与重水交换的中子显微断层成像为可视化和研究水的流动性提供了一种新方法，该方法此前尚未在膝关节软组织中得到探索。研究人员从牛膝关节中获取关节软骨和半月板样本，并在将重水施加于组织表面时采用中子断层成像进行成像。随后，这些图像与基于MRI的扩散张量成像（DTI）结果互为补充，并利用有限元模型从中子数据中估算扩散系数。两种模态下估算的扩散系数范围均在1.0至2.0×10-3 mm2/s之间。扩散过程可通过相对水浓度随时间的变化被清晰可视化并定量表征。研究结果表明，该研究建立了一种研究膝关节软组织内水流动性的新方法，在探究水流动性对膝关节生物力学的影响以及组织水流动性改变与疾病相关组织退变之间的关联方面具有广泛的应用潜力。

论文解读

一、研究背景与问题提出

膝关节是人体最大的关节之一，在日常活动中持续承受静态和动态机械负荷。承担负荷传导功能的主要是附着于股骨、髌骨和胫骨的关节软骨以及位于关节软骨面之间的半月板。这两种组织维持承重能力的关键在于其高含水量——关节软骨含水量达65%至80%，其余成分主要为II型胶原和蛋白聚糖。组织内的水及其流动性赋予了组织黏弹性力学特性。更为关键的是，这些组织大部分区域无血管分布，因此主要依赖扩散作用完成营养物质的供应。

水扩散是指水的随机运动，在生物系统中受细胞膜、大分子和结构基质的限制。关节软骨和半月板的实测扩散系数因此低于自由水，且依赖于组织微结构。关节软骨中，胶原纤维在浅表层与组织表面平行排列，经中间带过渡后在深层区转为垂直于表面排列；蛋白聚糖嵌入纤维网络之中，其浓度随组织深度增加。半月板则由I型胶原纤维构成，纤维方向随深度在三个结构层中变化：浅表层为致密网状，中间层主要为垂直于半月板新月形态的放射状排列，中心层则主要沿新月形态走行。这种结构各向异性导致半月板中水扩散沿周向纤维方向更快、沿垂直于纤维的放射方向更慢。骨关节炎等疾病引起的退变会破坏胶原网络的有序结构，中断水的优先扩散通路，并导致蛋白聚糖不规则耗竭，从而降低组织含水量并削弱承重能力。因此，膝关节软组织中的水扩散系数变化被认为是骨关节炎等疾病的重要生物标志物，对早期疾病检测具有重要意义。

此前对膝关节软组织扩散过程的研究主要依赖磁共振成像（MRI），特别是扩散张量成像（DTI），其测量时间尺度为毫秒级。然而，这一时间尺度与决定组织承重和营养供应的持续性（数小时至数天）宏观传输和肿胀现象仅存在间接关联。此外，DTI的空间分辨率有限，难以精细解析组织深度方向上的扩散特性差异。中子成像则提供了一种替代途径——中子能够区分普通水（H₂O）和重水（D₂O），此前已被应用于骨、植物和多孔岩石中水运动的研究，并已初步证明关节软骨中H₂O/D₂O交换可用于可视化蛋白基质密度的空间变化。然而，中子成像在半月板中的应用尚未建立，且通过宏观尺度H₂O/D₂O交换测量与长期生理传输相关的扩散系数，是当前文献中缺失的关键环节。

基于上述背景，研究人员旨在首次开展时间分辨的中子断层成像，对关节软骨和半月板中的水扩散过程进行可视化，量化H₂O-D₂O比值随时间的变化，并推导深度分辨的扩散系数。同时，通过补充DTI测量，实现中子断层成像测得的宏观扩散与DTI测得的局部毫秒级扩散之间的对比。

二、研究内容与主要结论

研究人员从2个骨骼成熟牛（15至24月龄）膝关节中获取样本：使用空心钻从股骨内侧髁取得含软骨和软骨下骨的5 mm骨软骨栓（n=4，每关节2个），使用活检冲头从半月板中央区域提取5 mm直径的半月板栓（n=3，来自2个关节）。样本在成像前于-20°C的磷酸盐缓冲液（PBS）中冷冻保存。

研究得出以下核心结论：中子断层成像能够清晰可视化关节软骨和半月板中的宏观水扩散过程。关节软骨中扩散相对较快，约2 mm厚的组织在2小时内完全饱和；半月板样本饱和时间更长，8小时实验时长未能捕捉到饱和过程的终点。扩散系数在两种模态（中子成像与DTI）下估算范围一致，均为1.0至2.0×10^-3 mm²/s。该研究首次建立了利用中子断层成像研究膝关节软组织水流动性的新方法，为研究水流动性对膝关节生物力学的影响以及水流动性改变与疾病相关组织退变之间的关联提供了广泛的应用前景。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了三种核心技术手段。其一为原位中子断层成像：样本解冻后用聚四氟乙烯（PFTE）胶带包裹，仅暴露组织顶面以限制扩散仅从顶面进入，随后置于带盖PFTE管中，在法国格勒诺布尔ILL的D50-NeXT束线进行成像。先采集参考断层图，再手动注入D₂O-PBS后连续采集断层图（半月板8小时、关节软骨2小时），半月板每幅断层图22.5分钟、关节软骨每幅5.6分钟，有效体素尺寸14.3 μm。软骨实验结束后额外采集X射线断层图以区分骨与软骨。其二为扩散张量MRI（DTI）：在中子成像后，样本在过量PBS中浸泡48小时以确保D₂O完全交换，随后在11.7 T Bruker Neo 500 NMR谱仪上进行成像，分辨率200 μm各向同性体素，b值550 s/mm²，6个非共线方向，使用FSL的dtifit函数拟合扩散张量模型。其三为有限元（FE）扩散建模：基于菲克定律建立一维有限元模型，假设扩散系数随深度线性递减后保持恒定，通过全局化Nelder-Mead方法同时调优参数m、d_c和k，最小化实验与模拟浓度之间的归一化均方根误差，从而识别扩散系数。

四、研究结果

4.1 中子断层成像能有效可视化宏观扩散

中子断层序列的纵向切面清晰展示了扩散过程。关节软骨中扩散较快，约2 mm组织厚度在2小时内完全饱和；半月板样本饱和时间更长，8小时实验时长未能捕捉饱和终点。然而，较厚的组织带来的更长饱和时间允许使用更长、噪声更低的断层扫描。软骨的信噪比（SNR）范围为5-11，半月板为10-17；水合组织与D₂O饱和组织之间的对比度噪声比（CNR）范围为1.5-4。

4.2 扩散过程随时间变化可量化

通过对灰度值进行归一化处理（软骨以初始和最终体积为参照，半月板以D₂O参考断层图为参照），降采样4倍以降低噪声并滤除异常值后，研究人员以57.2 μm的离散深度步长从组织表面开始对浓度进行平均，获得了随深度和时间变化的扩散剖面。该剖面清晰展示了D₂O从表面向组织内部逐步渗透的过程，相对水浓度随时间的变化可被定量表征。

4.3 扩散系数的深度依赖性

有限元模型拟合结果表明，扩散系数随深度呈线性递减趋势，在特定深度后保持恒定。关节软骨和半月板的扩散系数估算范围均在1.0至2.0×10^-3 mm²/s之间。这一深度依赖性反映了组织微结构随深度的变化——关节软骨中胶原纤维方向和蛋白聚糖浓度随深度变化，半月板中纤维方向在不同结构层中改变，均影响水的扩散特性。

4.4 DTI测量与中子成像结果的对比

DTI测量获得的平均扩散率（MD）和扩散张量特征值同样显示扩散系数在1.0至2.0×10^-3 mm²/s范围内。两种模态——中子断层成像测得的宏观扩散系数与DTI测得的毫秒级局部扩散系数——结果高度一致，表明宏观扩散过程与微观扩散特性之间存在对应关系，也验证了中子成像方法测量扩散系数的可靠性。

五、讨论与结论

研究讨论指出，中子成像通过观察H₂O/D₂O在分钟至小时时间尺度上的宏观交换，能够测量与长期生理传输相关的扩散系数，填补了当前文献中的关键空白。与DTI相比，中子成像提供了更高的空间分辨率（14.3 μm对比200 μm），能够解析组织深度方向的扩散差异。两种模态结果的一致性表明，毫秒-微米尺度的扩散MRI与宏观扩散之间不存在显著差异，这为两种方法在研究和临床中的互补应用提供了依据。

研究结论认为，该研究首次实现了利用时间分辨中子断层成像对关节软骨和半月板中水扩散的可视化和定量分析。扩散系数在两种模态下估算范围一致（1.0至2.0×10^-3 mm²/s），扩散过程可通过相对水浓度随时间的变化被清晰可视化和量化。该方法为研究膝关节软组织水流动性建立了新的技术途径，在探究水流动性对膝关节生物力学的影响以及水流动性改变与疾病相关组织退变之间的关联方面具有广泛的应用潜力，有望为骨关节炎等疾病的早期检测和机制研究提供新的工具。