《Materialia》：Anterior cruciate ligament in the osteoarthritic human knee: microstructural and compositional changes, and their relationship to biomechanical properties
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在人类前交叉韧带（ACL）中，已有报道显示膝骨关节炎（OA）伴随胶原纤维分散和粘液样改变。然而，关于前内侧（AM）束和后外侧（PL）束中与膝OA相关的成分及纤维和原纤维水平变化的定量信息尚属空白，且这些变化对生物力学特性的影响了解有限。研究人员采集了18个人膝
在人类前交叉韧带（ACL）中，已有报道显示膝骨关节炎（OA）伴随胶原纤维分散和粘液样改变。然而，关于前内侧（AM）束和后外侧（PL）束中与膝OA相关的成分及纤维和原纤维水平变化的定量信息尚属空白，且这些变化对生物力学特性的影响了解有限。研究人员采集了18个人膝关节（9具尸体）AM束和PL束中段样本，测定水、羟脯氨酸、弹性蛋白和尿酸含量、胶原纤维卷曲长度和角度，以及胶原原纤维D周期、直径和平行度指数（表示原纤维平行/分散程度）。这些膝关节的软骨退变及韧带样本的生物力学特性已在研究人员早期研究中通过OARSI分级和拉伸测试进行评估。成分和结构特性与OARSI分级及生物力学特性之间的关系采用Spearman相关分析评估。在AM束中，随着髌骨或股骨沟OARSI分级增加，羟脯氨酸含量和原纤维直径增加，D周期变得更加均匀（|rho|≥0.481，p≤0.043）。随着股骨外侧OARSI分级增加，AM束卷曲角度增加而PL束卷曲角度减小（|rho|≥0.514，p≤0.030）。平行度指数变异与粘性特性呈正相关（rho≥0.386，p≤0.032）。随着髌股关节OA进展，AM束胶原原纤维增粗且排列更加紧密，可能增加承载能力。卷曲角度在外侧OA中表现为AM束增加和PL束减小。这些可能是骨关节炎膝关节中环境改变的适应性表现。原纤维分散与粘性响应相关，表明胶原网络是OA中时间依赖性特性改变的贡献因素。
研究背景：前交叉韧带（ACL）连接股骨与胫骨，限制胫骨前移和胫骨内旋，解剖上可分为前内侧（AM）束和后外侧（PL）束。ACL组织主要由水、胶原、弹性蛋白、蛋白聚糖和细胞组成，胶原被认为是韧带中主要的承载成分。膝骨关节炎（OA）涉及关节软骨和软骨下骨的进行性功能和结构改变，伴随炎症和疼痛。软骨降解导致松弛度增加，疼痛可降低个体身体活动，炎症改变生化环境并促进疼痛。这些关节环境变化可能导致ACL成分和微结构的适应性改变，进而引起生物力学变化；反之，ACL特性改变影响软骨负荷，可能进而影响软骨改变的进展，在OA受累膝关节中形成相互作用。以往关于ACL微结构变化与膝OA的研究采用组织学评分系统，显示ACL退变与软骨退变相关，且PL束退变较AM束更严重，但缺乏完全客观的定量数据。此外，尚无文献报道ACL胶原卷曲结构（卷曲长度、卷曲角度）或胶原原纤维形态（直径、D周期）随膝OA的变化，也无文献将ACL生化成分变化与人类膝关节OA相关联，将ACL结构与成分变化同生物力学特性相结合的研究同样缺乏。因此，本研究的目的是：1）将人ACL成分变化与膝OA相关联；2）将纤维和原纤维水平变化与膝OA相关联；3）将成分及纤维和原纤维水平特性与骨关节炎膝关节ACL的生物力学特性相关联。研究结果对骨关节炎膝关节ACL带来新的认识，推进对结构-功能关系的理解，为治疗靶点提供见解，辅助人工移植物开发，并支持基于成分的计算模型开发。
研究人员开展了以下研究：从芬兰Kuopio大学医院获取18个人膝关节（9具尸体，年龄和性别：59M、68M、68M、68M、69M、69F、74M、79F、79M）的ACL，按照北萨沃医院区伦理许可134/2015进行。样本浸没于磷酸盐缓冲盐水中并储存于-20°C冰箱。测试前样本在室温下解冻，切分为AM束和PL束，并沿纵向切分为拉伸测试、组织学和组织块（图1b）。拉伸测试块用于生物力学表征，之后分为两个较小样本用于成分表征。组织学块经10%福尔马林固定、乙醇脱水、石蜡包埋、切成5 μm厚切片（每样本3张切片）、二甲苯脱蜡、透明质酸酶消化蛋白聚糖后安装于载玻片。剩余组织块储存于冰箱，解冻后沿纵向提取少量纤维束置于载玻片空气干燥2小时。研究结论：本研究表明ACL成分和原纤维水平特性与OA之间存在关系，例如在髌股关节OA进展阶段胶原含量和原纤维直径增加。此外，卷曲角度与股骨外侧OA相关，AM束增加而PL束减小。这些发现可能是ACL对骨关节炎膝关节中环境改变的适应性表现。胶原和弹性蛋白含量与较高的动态刚度和降低的粘性响应相关，而胶原原纤维取向分散与较高的粘性响应相关。这为ACL的结构-功能关系提供了新信息，有助于靶向治疗努力和计算材料模型开发。研究意义：虽然OA被认为是全关节疾病，但OA期间ACL的成分和结构变化仍知之甚少，多个方面的定量数据缺乏。本研究将人ACL的生化成分及纤维和原纤维水平结构特性与膝OA和生物力学特性相关联。结果强调ACL中与OA相关的成分和微结构变化存在，且这些特性在一定程度上影响生物力学功能，带来对骨关节炎膝关节ACL的新认识并推进结构-功能关系知识。所呈现的信息有助于靶向治疗努力、辅助人工ACL移植物开发并支持计算材料模型开发。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：从9具尸体获取18个人膝关节ACL样本（芬兰Kuopio大学医院，伦理许可134/2015）；采用比色生化方法测定水、羟脯氨酸、弹性蛋白和尿酸含量；采用偏振光显微镜测定胶原纤维卷曲长度、卷曲角度和平行度指数；采用原子力显微镜（AFM）在非接触模式下测定胶原原纤维D周期和直径；生物力学表征（拉伸应力松弛测试和正弦加载测试）及软骨OARSI分级在此前研究中完成并在此结合使用；采用线性混合模型和Spearman秩相关进行统计分析。
研究结果：
3.1 AM束和PL束生化成分及纤维和原纤维水平特性的比较：PL束湿重归一化弹性蛋白含量较AM束高9.7%（p=0.047），其他成分、纤维或原纤维水平特性在两束间无差异。个体样本原纤维直径分布大多呈单峰分布。
3.2 关节软骨退变分级：各软骨部位观察到的最大OARSI分级范围从接近健康（1级）到侵蚀或严重退变（5级），以部位内最大OARSI分级分类时无部位为完整软骨（0级）。内侧和外侧胫骨平台部位超过半数样本显示OARSI 4级。由于变异性有限，研究人员认为与内侧和外侧胫骨OARSI分级的相关分析无意义，但通过所有部位OARSI分级的SRSS予以考虑。
3.3 成分及纤维和原纤维水平特性与OARSI分级的相关性：在AM束中，羟脯氨酸含量（干重）与股骨沟（rho=0.545，p=0.019）和髌骨（rho=0.481，p=0.043）OARSI分级呈正相关；PL束中无成分参数与OARSI分级显著相关。AM束中卷曲角度与股骨前外侧OARSI分级呈正相关（rho=0.514，p=0.029）；PL束中卷曲角度与股骨后外侧OARSI分级呈负相关（rho=-0.527，p=0.030）。AM束中D周期标准差与髌骨OARSI分级呈负相关（rho=-0.503，p=0.033），原纤维直径（rho=0.597，p=0.009）和原纤维直径标准差（rho=0.506，p=0.032）与股骨沟OARSI分级呈正相关。
3.4 成分与生物力学特性的相关性：水含量与平衡模量（rho=-0.371，p=0.028）和12%应变下慢速松弛时间（rho=-0.380，p=0.029）呈负相关，与9%和12%应变下峰值-平衡应力比呈正相关（rho=0.342、0.424，p=0.044、0.014）。羟脯氨酸含量（湿重）与12%应变下峰值-平衡比呈负相关（rho=-0.365，p=0.037），与快速松弛时间呈正相关（rho=0.368，p=0.035）；羟脯氨酸含量（湿重）与0.5、0.75、1、1.25、1.5和4 Hz频率下相位差呈负相关（rho≤-0.365，p≤0.037），与所有频率下动态模量呈正相关（rho≥0.355，p≤0.042）。羟脯氨酸含量（干重）与6%应变下慢速松弛时间呈正相关（rho=0.339，p=0.046），与1、1.25和4 Hz频率下相位差呈负相关（rho≤-0.355，p≤0.043）。弹性蛋白含量（湿重）与6%、9%和12%应变下峰值-平衡比呈负相关（rho≤-0.407，p≤0.015）；与0.01至1.5 Hz及4和5 Hz加载频率下相位差呈负相关（rho≤-0.388，p≤0.026），与所有加载频率下动态模量呈正相关（rho≥0.353，p≤0.044）。弹性蛋白含量（干重）与6%应变下慢速松弛时间呈负相关（rho=-0.339，p=0.046）。尿酸含量（湿重）与1.25和2 Hz加载频率下相位差呈负相关（rho≤-0.367，p≤0.036），尿酸含量（干重）与2 Hz频率下相位差呈负相关（rho=-0.392，p=0.024）。
3.5 纤维水平特性与生物力学特性的相关性：卷曲长度与平衡和峰值极限应变（rho=0.345、0.378，p=0.046、0.027）及极限强度（rho=0.430、0.432，p=0.011、0.011）呈正相关；与12%应变下峰值-平衡比呈负相关（rho=-0.409，p=0.018），与慢速松弛幅度呈正相关（rho=0.345，p=0.049）；与所有频率下动态模量呈正相关（rho≥0.362，p≤0.038）。
3.6 原纤维水平特性与生物力学特性的相关性：样本内胶原原纤维D周期标准差与3%、6%和9%应变下快速松弛幅度呈负相关（rho≤-0.394，p≤0.021），与6%应变下慢速松弛幅度呈负相关（rho=-0.395，p=0.021）。样本内胶原原纤维直径标准差与9%应变下快速松弛幅度呈正相关（rho=0.371，p=0.031）。Sarle双峰系数与12%应变下峰值-平衡比（rho=0.358，p=0.044）及0.01和0.25 Hz加载频率下相位差（rho=0.353、0.352，p=0.048、0.048）呈正相关。原纤维平行度指数半高全宽（FWHM）与极限平衡强度呈负相关（rho=-0.363，p=0.041），与3%、6%和9%应变下峰值-平衡比呈正相关（rho≥0.392，p≤0.024），与0.01至0.25、0.75至1.25及2和3 Hz加载频率下相位差呈正相关（rho≥0.386，p≤0.032）。
讨论部分总结：本研究目的是将人ACL成分及纤维和原纤维水平结构变化与膝OA相关联，并将这些特性与ACL生物力学特性相关联。主要结果为：在AM束中，羟脯氨酸含量（干重）、卷曲角度和原纤维直径随OA增加，而PL束中卷曲角度减小。羟脯氨酸和弹性蛋白含量（湿重）与较高刚度和降低的粘性响应相关，卷曲长度与较高极限强度相关，原纤维分散与增加的粘性响应相关。结果表明ACL中与骨关节炎相关的成分和微结构变化存在，甚至在原纤维水平，但这些与生物力学特性的关联有限。与文献值比较：羟脯氨酸含量（干重）值高于先前报道的人ACL但在此前报道的牛ACL范围内，可能由于不同研究采用不同的羟脯氨酸测定方法。人ACL弹性蛋白含量此前未见报道，无法直接比较，但所得值低于先前报道的犬和牛ACL，可能由于物种差异。人ACL尿酸含量同样未找到比较，但所得值低于研究人员此前报道的牛ACL。卷曲长度高于先前报道的38岁和42岁人ACL，可能由于本研究样本年龄较大。人ACL卷曲角度未找到比较，但所得值低于动物ACL报道值。原纤维D周期高于文献报道值，可能由于其研究尸体年龄较轻。胶原原纤维平均直径略高于先前报道的人ACL，可能由于本研究样本来源于骨关节炎膝关节，因为股骨沟OA与原纤维直径增加相关。胶原原纤维直径分布大多呈单峰，与先前人样本文献相似；动物ACL文献强调健康ACL呈双峰分布而损伤组织呈单峰分布，提示本研究骨关节炎膝关节AM和PL样本原纤维直径可能与损伤组织相似。原纤维平行度指数值未找到人ACL比较，但值与膝 articular 软骨深层区相对应。除弹性蛋白含量（湿重）外，成分或微结构特性在AM和PL束间无差异，尽管先前研究显示PL束退变更严重，可能由于骨赘使髁间窝变窄。与OARSI分级的相关性：在AM束中，随着髌股关节OA进展，羟脯氨酸含量（即干重胶原含量）、胶原原纤维直径及原纤维直径变异增加，D周期变异减小。胶原原纤维似乎在髌股关节OA中增粗，可解释干重含量增加的原因。较粗原纤维可能增加原纤维内交联，导致原纤维内分子滑动减少，从而促成更均匀的D周期。粗胶原原纤维与高拉伸载荷承载相关，因此AM束负荷可能因髌股关节OA而增加；应注意衰老降低ACL原纤维直径，因此髌股关节OA似乎具有相反效应。AM和PL束卷曲角度与股骨外侧OA相关，AM增加而PL减小，可能是股骨外侧OA增加AM负荷而减少PL负荷，因为已观察到卸载降低人ACL卷曲角度。负荷增加可诱导更多纤维间滑动，在去除负荷时产生较高卷曲角度。PL束中纤维间滑动可能恢复更好，导致静息时卷曲角度较低。有趣的是，未观察到两束成分和微结构与股骨前内侧OARSI分级的关系，尽管研究人员此前涉及相同标本的研究表明两束粘性特性尤其与内侧OA相关。与生物力学特性的相关性：较高水含量似乎促进松弛并降低平衡模量，水可影响纤维-纤维相互作用，因为纤维滑动已被确定为肌腱松弛的主要贡献因素，也促成平衡模量降低。羟脯氨酸和弹性蛋白含量与生物力学特性显示相似相关性，含量增加与降低的粘性响应和增加的material刚度相关。尿酸含量与某些加载频率下相位差呈负相关，轻度提示蛋白聚糖对粘性响应的降低效应，但应承认蛋白聚糖对韧带和肌腱力学行为的影响尚无定论。卷曲角度未显示与任何力学参数相关，尽管其与韧带和肌腱力学功能相关。卷曲长度与极限强度和应变及所有加载频率下动态模量呈正相关，卷曲长度可能间接与较高承载能力或对较高应力的适应相关，因为卷曲长度与原纤维直径呈正相关，而原纤维直径与较高载荷承载相关。胶原原纤维D周期变异与快速松弛幅度呈负相关，由于松弛机制主要依赖纤维水平滑动，结果可能表明若纤维滑动能力降低，原纤维伸长作为张力下伸长机制被强调。原纤维直径变异及双峰系数增加与某些粘性特性呈正相关，可能间接与纤维水平滑动能力相关或促进原纤维水平现象更多贡献于组织松弛。胶原原纤维平行度指数FWHM与松弛量和相位差呈正相关，意味着胶原原纤维取向越分散，组织越粘。此关系与先前发现一致，因为OA受累膝关节ACL中已报道纤维分散和增加粘性响应。研究人员推测随着细胞外基质降解和胶原网络分散，在拉伸载荷下胶原原纤维和纤维具有增加的重组、滑动和重取向能力，以至于不再承担那么多载荷。纤维和原纤维在各自层级水平上可能相互连接减少，允许更多重取向和分散。局限性：尸体数量为9，未来研究纳入更多尸体将有助于进一步加强研究；年龄效应未纳入分析，但其对结果影响被认为较小，因为9具尸体中5具年龄为68至69岁，限制了变异；尸体体重未知，无法评估其影响；未来研究应寻求纳入更年轻和更健康标本以建立全面基线组；本研究发现不一定可推广至年轻人群，但与患OA的老年人群相关；纤维水平特性测定基于手工选择感兴趣区域分析，每样本调查三个不同切片减轻ROI选择影响；原纤维D周期和直径每样本分析30根原纤维并认为具有代表性；本研究包含大量相关分析，增加I型错误风险，但许多相关性显示一致性，增加结果可靠性。研究结论翻译：总之，本研究表明ACL成分和原纤维水平特性与OA之间存在关系，例如在髌股关节OA进展阶段胶原含量和原纤维直径增加。此外，卷曲角度与股骨外侧OA相关，AM束增加而PL束减小。这些发现可能是ACL对骨关节炎膝关节中环境改变的适应性表现。胶原和弹性蛋白含量与较高的动态刚度和降低的粘性响应相关，而胶原原纤维取向分散与较高的粘性响应相关。这为ACL的结构-功能关系提供了新信息，有助于靶向治疗努力和计算材料模型开发。
