基于CRISPR-Cas9靶向突变CmSLM/CmAGL11创制实心胎座少籽甜瓜新种质

《Molecular Horticulture》：De novo creation of solid-placenta, few-seeded melon via targeted mutation of CmSLM/CmAGL11

种子是大多数被子植物的主要生殖器官，对植物生命周期至关重要，因其储存遗传物质并为幼苗早期生长提供营养（He等，2026）。然而，无籽性状通过提高可食用比例和消除硬籽显著改善了鲜食和加工用果实品质，使其成为最具价值的园艺性状之一（Wang等，2021）。无籽果实可自然发生，也可通过激素处理、倍性操作或遗传工程诱导产生（Pang等，2025）。已有研究表明，单性结实（parthenocarpy）和败育型无籽（stenospermocarpy）是果实无籽形成的两种不同机制（Royo等，2018）。在单性结实中，果实无需授粉或受精即可从子房发育而来，如黄瓜中所观察到的；而在西瓜中，无籽可通过三倍体植株的常规育种或应用激素类似物如N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲（CPPU）实现。相比之下，败育型无籽涉及成功授粉和受精后，由于珠被或胚乳形成缺陷而导致种子发育败育，该过程导致果实正常膨大而仅残留退化种子痕迹，如无籽葡萄中所见（Royo等，2018）。随着遗传工程的最新进展，基因组编辑已成为产生无籽果实的可行途径，如无籽西瓜（Jiang等，2024）。 MADS-box基因编码植物中调控多种生理和发育过程的主要转录因子家族（Favaro等，2025）。在花器官发育的ABCDE模型中，调控雄蕊和心皮形成的C类基因AG以及调控胚珠发育的D类基因STK（原AGL11）、SHP1和SHP2均属于拟南芥II型MADS-box基因的AG亚家族（Pinyopich等，2003；Mizzotti等，2012）。此外，番茄D类基因SlMBP3/AFF的功能研究表明，其突变导致全果肉果实、胎座不液化以及严重畸形且缺乏种皮的种子（Zhang等，2019；Huang等，2021）。在葡萄中，VviAGL11的单氨基酸替换（R197L）赋予败育型无籽表型（Royo等，2018）。尽管有这些发现，这些基因在葫芦科作物中的功能是否保守仍不清楚。 甜瓜是葫芦科中重要的园艺作物，与西瓜亲缘关系密切，尽管其可食组织在解剖学上有所不同。在西瓜中，果肉主要来源于肉质胎座；而在甜瓜中，可食用部分主要由中果皮和内果皮组成，其在果实成熟过程中随胎座液化而扩张。甜瓜中单性结实的遗传资源有限，且在商业化育种中仍未得到充分利用。此外，即使在CPPU处理后，种皮形成往往仍然存在。因此，开发无籽或少籽甜瓜品种是一项紧迫的育种目标。 在本研究中，研究人员对甜瓜MADS-box基因进行了全基因组鉴定，共鉴定到46个MADS-box基因，包括13个I型和33个II型成员（表S1）。II型基因进一步分为12个亚家族（图S1；表S1）。AG亚家族的系统发育分析确定了该组中4个甜瓜基因（图1A）。其中，MELO3C033521与AFF、STK和VviAGL11的系统发育关系最为接近，蛋白质序列相似性分别为56.9%、60.6%和88.3%（图1A）。基于此关系并为了便于功能分析，该基因被命名为CmSLM（Cucumis melo solid-placenta and less-seed melon）。为同时反映其分子同源性和功能特征，本研究全程将其称为CmSLM/CmAGL11。 亚细胞定位分析显示，CmSLM/CmAGL11-GFP融合蛋白与核标记物RFP标记的HTB2共定位（图1B）。组织特异性表达分析显示其在两性花和果实中优势表达，在胎座中水平特别高（图S2）。一致地，果实原位杂交表明CmSLM/CmAGL11转录本主要定位于胎座，在发育种子中检测到强信号（图1C），提示其在种子发育中的作用。为进一步阐明CmSLM/CmAGL11的功能，研究人员构建了包含两个靶向CmSLM/CmAGL11第三和第四外显子的sgRNA的CRISPR/Cas9载体，并通过农杆菌介导转化导入薄皮甜瓜自交系IVF105（图1D，S3）。获得5个阳性T0转基因系，并通过Sanger测序确认两个靶位点的突变。选取3个独立T2纯合突变系（cr1、cr2和cr3）进行进一步分析。编辑系cr1和cr2分别在第一个和第二个靶位点携带由碱基插入或缺失引起的移码突变，导致缺乏K-box结构域截短蛋白（图1E，S4，S5）。相比之下，cr3表现出大片段缺失，消除了两个保守结构域（图1E，S5，S6）。此外，所有三个突变体中CmSLM/CmAGL11转录水平均显著降低（图S6）。T3代农艺性状评估显示，突变系与WT在株高和果实发育周期方面无显著差异（图S7A，B）。果实成熟期间，突变果实与WT果实的单果重和可溶性固形物含量相当，而突变系果皮硬度显著高于WT（图S7C-E）。 成熟果实内部检查显示突变系与WT之间存在显著差异（图1F，G）。WT果实胎座组织完全液化，而所有突变体均保留非液化实心胎座，导致胎座硬度增加15至30倍（图1H）。成熟WT果实通常含有约400粒种子，而所有三个突变系的种子数量均显著减少（图1I，G，S8A）。特别是cr3突变体仅产生0-3粒正常种子，伴随13.5±3.2粒败育种子（图1I，G，S8A，S9）。杂合编辑植株以及cr3突变体与WT杂交的F1后代均表现正常果实表型，表明该突变是隐性的。与WT相比，突变体种子表现出更薄的种皮，易开裂并呈现大量纵向表面条纹，同时千粒重显著降低（图S8B，S10）。成熟干种子的扫描电子显微镜进一步显示，突变体种皮具有突出的细胞壁突起和丰富的不定长宽带状结构，而WT中观察到光滑且规则排列的表皮细胞（图1K）。半薄切片显示突变体种皮下表皮层的大小和厚度均大幅减少，为其脆性增加提供了结构基础（图1L，M）。综合这些发现表明，甜瓜CmSLM/CmAGL11基因参与调控胎座液化和支持正常种子发育。 总之，CmSLM/CmAGL11功能丧失导致胎座不液化和种子发育严重受损。特别是，大片段缺失产生以实心胎座和近无籽果实为主的表型，与西瓜相似。与CPPU诱导的保留空种皮的无籽甜瓜不同，本研究产生的实心胎座少籽甜瓜是通过破坏MADS-box基因实现的。展望未来，优化CmSLM/CmAGL11靶位点、去除外源载体序列以及与CPPU处理相结合，可能有助于开发优良的真正无籽甜瓜品种。

论文解读：基于CRISPR-Cas9靶向突变CmSLM/CmAGL11创制实心胎座少籽甜瓜新种质

一、研究背景与科学问题

种子作为大多数被子植物的主要生殖器官，在植物生命周期中承担着储存遗传物质和为幼苗早期生长提供营养的关键功能。然而，在园艺作物中，无籽性状因能显著提高果实可食用比例、消除硬籽对鲜食和加工品质的不利影响，已成为最具经济价值的育种目标之一。无籽果实的形成主要涉及两种机制：单性结实（parthenocarpy）指果实无需授粉受精即可从子房发育，如黄瓜；败育型无籽（stenospermocarpy）则指授粉受精正常完成后，种子因珠被或胚乳发育缺陷而败育，果实正常膨大但仅残留种子痕迹，如无籽葡萄。在MADS-box基因家族中，拟南芥D类基因STK（AGL11）、SHP1和SHP2调控胚珠发育，番茄SlMBP3/AFF突变导致胎座不液化和种子畸形，葡萄VviAGL11的R197L单氨基酸替换则赋予败育型无籽表型。然而，这些D类基因在葫芦科作物中的功能是否保守此前尚不清楚。

甜瓜作为葫芦科重要园艺作物，其可食部分主要为中果皮和内果皮，在果实成熟过程中随胎座液化而扩张，与西瓜果肉来源于肉质胎座的解剖结构不同。甜瓜单性结实遗传资源有限且未在商业化育种中充分利用，CPPU处理后种皮形成仍常存在。因此，开发无籽或少籽甜瓜品种是当前紧迫的育种目标。基于此，研究人员开展了甜瓜MADS-box基因全基因组鉴定及CmSLM/CmAGL11功能解析研究。

二、研究内容与主要结论

研究人员对甜瓜MADS-box基因进行了全基因组鉴定，共获得46个成员，包括13个I型和33个II型基因。系统发育分析确定AG亚家族包含4个甜瓜基因，其中MELO3C033521与AFF、STK和VviAGL11亲缘关系最近，蛋白质序列相似性分别为56.9%、60.6%和88.3%，被命名为CmSLM/CmAGL11。亚细胞定位证实CmSLM/CmAGL11-GFP融合蛋白定位于细胞核；组织特异性表达和原位杂交显示该基因在两性花和果实胎座中优势表达，在发育种子中信号强烈。研究人员构建含双sgRNA的CRISPR/Cas9载体，通过农杆菌介导转化导入薄皮甜瓜自交系IVF105，获得3个T₂纯合突变系cr1、cr2和cr3。cr1和cr2分别携带第一和第二靶位点的移码突变导致截短蛋白，cr3为大片段缺失消除两个保守结构域。表型分析显示，突变系与WT在株高和果实发育周期上无显著差异，单果重和可溶性固形物含量相当，但果皮硬度显著增加。成熟果实内部检查发现，WT胎座完全液化，而所有突变体保留实心非液化胎座，胎座硬度增加15至30倍；WT果实约含400粒种子，突变系种子数显著减少，其中cr3仅产生0-3粒正常种子并伴随约13.5粒败育种子。杂合编辑植株和cr3与WT杂交的F₁代果实表型正常，表明突变呈隐性遗传。突变体种子种皮变薄易裂，出现大量纵向条纹，千粒重显著降低；扫描电镜显示突变体种皮具有突出细胞壁突起和带状结构，半薄切片证实下表皮层大小和厚度大幅减少。研究结论表明，CmSLM/CmAGL11功能丧失导致胎座不液化和种子发育严重受损，大片段缺失可产生以实心胎座和近无籽果实为主的表型，与西瓜果实特征相似。与CPPU诱导的保留空种皮的无籽甜瓜不同，该研究通过破坏MADS-box基因创制了实心胎座少籽甜瓜。未来优化靶位点、去除外源载体序列并结合CPPU处理，有望开发出真正无籽的优良甜瓜品种。

三、主要关键技术方法

本研究主要运用以下关键技术方法：全基因组MADS-box基因鉴定与系统发育分析，用于确定甜瓜AG亚家族成员及CmSLM/CmAGL11的分类地位；亚细胞定位分析，通过GFP融合蛋白和核标记物共定位验证蛋白核定位；原位杂交（in situ hybridization）检测基因在果实和种子中的时空表达模式；CRISPR-Cas9基因编辑技术，设计双sgRNA靶向第三和第四外显子，通过农杆菌介导转化获得纯合突变系；Sanger测序确认编辑事件；扫描电子显微镜（SEM）和半薄切片用于种皮结构分析；胎座硬度、种子数量、千粒重等农艺性状测定。研究材料为薄皮甜瓜自交系IVF105。

四、研究结果分述

CmSLM/CmAGL11的鉴定与表达特征：全基因组鉴定获得46个甜瓜MADS-box基因，AG亚家族含4个成员。MELO3C033521与AFF、STK和VviAGL11亲缘关系最近，被命名为CmSLM/CmAGL11。亚细胞定位证实其定位于细胞核，原位杂交显示转录本主要分布于胎座和发育种子中。

CRISPR-Cas9编辑突变体的获得：含双sgRNA的编辑载体转化IVF105后获得5个T₀阳性系，选取3个T₂纯合突变系。cr1和cr2为移码突变产生截短蛋白，cr3为大片段缺失消除两个保守结构域，三个突变系中CmSLM/CmAGL11转录水平均显著降低。

果实性状分析：突变系与WT在株高和果实发育周期上无显著差异，单果重和可溶性固形物含量相当，但果皮硬度显著升高。成熟果实中WT胎座完全液化，突变体胎座保持实心，硬度增加15至30倍。

种子性状分析：WT果实约含400粒种子，突变系种子数显著减少，cr3仅产生0-3粒正常种子并伴随败育种子。突变体种子种皮变薄易裂、千粒重降低，种皮下表皮层大小和厚度显著减少。

遗传分析：杂合编辑植株和cr3与WT杂交F₁代果实表型正常，证实该突变为隐性遗传。

五、讨论与结论

该研究首次在葫芦科作物中证实了D类MADS-box基因功能的保守性，表明CmSLM/CmAGL11在甜瓜胎座液化和种子发育中发挥关键调控作用。与CPPU诱导无籽甜瓜保留空种皮不同，该研究通过基因编辑直接破坏MADS-box基因，创制了实心胎座少籽甜瓜，果实表型与西瓜相似。研究结论指出，CmSLM/CmAGL11功能丧失导致胎座不液化和种子发育严重受损，大片段缺失可产生近无籽果实。展望未来，优化靶位点、去除外源载体序列以及与CPPU处理相结合，可能为开发真正无籽的优良甜瓜品种提供可行途径。该研究为甜瓜无籽育种提供了新的基因靶点和编辑策略，具有重要的理论意义和应用价值。