《Purinergic Signalling》：Single-cell transcriptomic analysis reveals fibroblast state-specific remodeling of purinergic signaling in diabetic gingiva
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糖尿病通过破坏牙周黏膜稳态并促进持续性慢性炎症，增加牙周炎的风险和严重程度。牙龈成纤维细胞通过细胞外基质重塑、免疫调节和组织修复，是牙周完整性的核心调节者。嘌呤能信号（purinergic signaling）是一条进化上保守的通路，调控细胞代谢和炎症反应，但
糖尿病通过破坏牙周黏膜稳态并促进持续性慢性炎症，增加牙周炎的风险和严重程度。牙龈成纤维细胞通过细胞外基质重塑、免疫调节和组织修复，是牙周完整性的核心调节者。嘌呤能信号（purinergic signaling）是一条进化上保守的通路，调控细胞代谢和炎症反应，但其在糖尿病背景下不同牙龈成纤维细胞状态中的作用仍知之甚少。为填补这一空白，研究人员分析了一个公开可获取的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，该数据集来自野生型（WT）和糖尿病db/db小鼠的牙龈组织。对成纤维细胞进行重新聚类以识别转录上不同的状态，并评估与细胞外核苷酸信号、腺苷信号、ATP释放及炎症小体相关通路（包括与Nlrp3炎症小体相关的通路）相关的基因。基因通过差异表达、点图、UMAP特征图和状态特异性log2倍数变化分析进行评估。识别出四种转录上不同的成纤维细胞状态。糖尿病牙龈表现出炎症性成纤维细胞状态的扩增，同时ECM重塑成纤维细胞减少。与细胞外核苷酸代谢和腺苷信号相关的基因显示出成纤维细胞状态特异性表达模式，包括Nt5e（CD73）、Entpd1（CD39）和Enpp1表达的糖尿病相关差异。腺苷受体基因Adora2a和Adora2b表达水平相对较低。与ATP释放相关的基因，包括 connexin-43（Gja1）和pannexin-1通道（Panx1），也显示出不同的状态特异性表达模式。经典炎症小体相关基因总体表达水平较低，其中Nek7总体表达最高，Casp11表现出状态特异性表达差异，包括在选定的糖尿病成纤维细胞状态中表达较高。这些发现识别了糖尿病牙龈中炎症性成纤维细胞的扩增，并表征了参与细胞外核苷酸和核苷信号、ATP释放及炎症小体相关通路的基因表达的糖尿病相关变化，这些变化在不同成纤维细胞状态间存在差异。
糖尿病是牙周炎的主要危险因素，与疾病严重程度增加、组织修复受损和炎症反应增强相关。慢性高血糖改变牙周微环境中的多种细胞过程，导致宿主反应失调，促进进行性组织破坏。尽管糖尿病与牙周炎之间的双向关系已充分确立，但糖尿病重塑牙龈组织的细胞机制仍不完全清楚。牙龈成纤维细胞是牙龈固有层中主要的基质细胞群体，在维持细胞外基质稳态、调节炎症和协调组织修复中发挥重要作用。越来越多的证据表明，牙龈成纤维细胞在转录和功能上具有异质性，由对炎症和代谢线索动态响应的不同细胞状态组成。细胞外ATP及其代谢物通过细胞外核苷酸信号和腺苷信号通路是炎症反应的重要调节者。细胞外ATP由外核苷酸酶依次水解，包括CD39（Entpd1）将ATP和ADP转化为AMP，以及CD73（Nt5e）催化AMP转化为腺苷。尽管细胞外核苷酸和腺苷信号失调已牵涉到包括牙周炎在内的炎症性疾病，但在糖尿病期间，与细胞外核苷酸代谢和嘌呤能信号相关的基因表达是否在不同牙龈成纤维细胞状态间存在差异仍未被探索。细胞外核苷酸信号还与炎症小体相关通路交叉，因为细胞外ATP可刺激P2受体并促进NLRP3炎症小体激活和促炎细胞因子产生。然而，炎症小体相关基因表达是否在不同成纤维细胞状态间存在差异并与糖尿病相关，研究较少。在本研究中，研究人员使用公开可获取的scRNA-seq数据来表征糖尿病牙龈组织中的成纤维细胞异质性，并定义与细胞外核苷酸和核苷信号、ATP释放及炎症小体相关通路相关的基因表达模式。通过整合全组织和成纤维细胞特异性分析，研究人员表征了与糖尿病加重牙周炎症相关的嘌呤能信号网络的成纤维细胞状态特异性改变。
研究人员开展了一项基于公共单细胞转录组数据集（GSE188217）的生物信息学分析研究，该数据集包含16周龄db/db糖尿病小鼠和16周龄野生型小鼠各一只的牙龈黏膜scRNA-seq数据。研究得出以下结论：糖尿病牙龈中炎症性成纤维细胞状态扩增而ECM重塑成纤维细胞减少；与细胞外核苷酸代谢、腺苷信号、ATP释放及炎症小体相关通路相关的基因表达呈现成纤维细胞状态特异性差异。该研究的意义在于提供了糖尿病牙龈中成纤维细胞状态特异性嘌呤能信号基因表达变化的描述性框架，为后续机制研究和细胞特异性治疗策略开发提供了基础。
研究人员为开展本研究用到的主要关键技术方法包括：从NCBI GEO数据库获取公开的scRNA-seq数据集（GSE188217，包含1只16周龄db/db小鼠和1只16周龄WT小鼠的牙龈组织）；使用R语言Seurat（v5）包进行质量控制、归一化、主成分分析（PCA）、Louvain聚类和UMAP降维；基于经典谱系标记基因进行细胞类型注释；对成纤维细胞和肌成纤维细胞群体进行提取和二次聚类（分辨率=0.2），基于差异表达标记基因（Wilcoxon秩和检验）注释成纤维细胞状态；采用平均表达量计算、点图、UMAP特征图和状态特异性log2倍数变化（db/db vs. WT）进行描述性比较分析。
研究结果如下：
糖尿病与牙龈细胞组成变化相关，包括成纤维细胞比例增加和上皮细胞群体减少：通过对WT和db/db小鼠整合scRNA-seq数据分析，鉴定出八种主要细胞群体，包括基底上皮细胞、活化上皮细胞、炎症性上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞、肌成纤维细胞和其他细胞。细胞组成比较显示，糖尿病牙龈中成纤维细胞是最扩增的细胞群体，伴随肌成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞比例增加，而上皮细胞群体相对减少。
成纤维细胞二次聚类鉴定糖尿病牙龈组织中炎症性转录状态的 predominance：将成纤维细胞和肌成纤维细胞群体从整合数据集中分离并进行二次聚类，解析出四种转录上不同的成纤维细胞状态：炎症性成纤维细胞（ preferentially expressed Ccl2、Ptgs2、Icam1）、ECM重塑成纤维细胞（高表达Postn、Fn1、Tnc）、肌成纤维细胞（高表达Acta2、Tagln、Myh11）和增殖性成纤维细胞（高表达Mki67、Top2a）。WT成纤维细胞主要以ECM重塑成纤维细胞为主，而糖尿病牙龈显示炎症性成纤维细胞扩增伴随ECM重塑成纤维细胞减少。定量分析证实了糖尿病牙龈中成纤维细胞组成的显著转变。
糖尿病与细胞外核苷酸代谢和腺苷信号相关基因表达改变相关：WT与db/db牙龈成纤维细胞比较显示Nt5e、Adora2a、Adora2b和Enpp1表达降低，而Ada、Adk和Entpd1在db/db中升高。点图分析显示这些基因在成纤维细胞亚型间呈现异质性表达。Nt5e在所有成纤维细胞亚型中均可检测到，在肌成纤维细胞中表达相对较低。Entpd1在肌成纤维细胞中富集且在db/db组织中表达较高。Enpp1主要在增殖性和炎症性成纤维细胞中表达。Enpp2在糖尿病组织的炎症性成纤维细胞中表达较高。腺苷受体基因Adora2a和Adora2b在成纤维细胞群体中表达水平相对较低。状态特异性描述性log2倍数变化进一步展示了db/db与WT成纤维细胞之间这些基因表达的差异。
糖尿病与跨成纤维细胞状态的细胞外核苷酸信号和ATP释放相关基因表达改变相关：总体而言，P2rx1、P2rx7、P2ry2和P2ry14在糖尿病成纤维细胞中表达较低。Gja1（编码connexin-43通道）也显示较低表达，而Panx1（pannexin-1）表达呈适度增加。Gja1显示最广泛的表达，在增殖性成纤维细胞中最为显著。P2rx1和P2ry14主要在肌成纤维细胞中检测到，而P2rx7在增殖性成纤维细胞中最为突出。状态特异性log2倍数变化分析显示Gja1在炎症性成纤维细胞中增幅最大，但在ECM重塑、肌成纤维细胞和增殖性成纤维细胞中降低。P2rx7在炎症性成纤维细胞中适度增加，但在其余成纤维细胞群体中主要降低。P2ry14在所有成纤维细胞亚型中一致降低，在炎症性成纤维细胞中降幅最大。
糖尿病与炎症小体相关基因表达的状态特异性差异相关：总体差异表达分析显示WT和db/db成纤维细胞之间炎症小体相关基因的转录模式存在差异。Pycard显示最广泛的表达，在增殖性成纤维细胞中最为显著。Casp1主要在增殖性成纤维细胞中富集，而Nek7主要在肌成纤维细胞中优先表达。Nlrp3和Il1b在各成纤维细胞状态中表达有限。状态特异性比较显示Nek7在ECM重塑和增殖性成纤维细胞中表达较高，但在炎症性和肌成纤维细胞群体中表达较低。Casp11在肌成纤维细胞中富集且在糖尿病条件下表达较高。Pycard在多个状态的db/db成纤维细胞中表达较低。Nlrp3、Il18和Gsdmd在WT和db/db成纤维细胞之间显示出相对适度的状态特异性差异。Δ表达分析显示最显著的增加为ECM重塑成纤维细胞中的Nek7，而Casp11主要在肌成纤维细胞中显示增加表达。尽管Il1b总体表达较低，但在ECM重塑成纤维细胞中最为明显。
讨论部分总结：糖尿病深刻改变牙龈基质微环境，但成纤维细胞功能障碍的分子机制仍不完全清楚。本研究分析了先前发表的db/db小鼠数据集，该模型与自发性牙周骨丧失相关。通过scRNA-seq，研究人员表征了糖尿病组织中牙龈成纤维细胞的转录景观，并识别了与细胞外核苷酸和核苷信号、ATP释放及炎症小体相关通路相关的基因表达的糖尿病相关差异。通过在不同成纤维细胞状态间检查这些模式，本研究提供了牙周微环境中与细胞外核苷酸代谢及相关信号通路相关的基因的糖尿病相关转录差异的状态分辨视图。由于数据集每种条件仅包含一个生物学样本的公认局限性，本文呈现的差异表达和成纤维细胞状态特异性比较被解释为描述性和假设生成性的。分析识别出炎症性成纤维细胞为糖尿病牙龈组织中的主要成纤维细胞状态，而ECM重塑成纤维细胞为最不显著的状态。这些发现与糖尿病相关的从组织稳态向结缔组织隔室持续性炎症表型的转变一致。尽管腺苷受体基因Adora2a和Adora2b表达水平相对较低，糖尿病与细胞外核苷酸代谢酶（包括Nt5e（CD73）、Entpd1（CD39）和Enpp1）的明显变化相关。CD39将细胞外ATP和ADP转化为AMP，而CD73催化AMP转化为腺苷。Enpp1通过水解细胞外核苷酸和环二核苷酸为AMP间接产生腺苷，AMP随后由CD73转化为腺苷。相比之下，Enpp2编码autotaxin，主要与溶血磷脂酸生成相关，应与直接参与ATP-腺苷通路的酶分开考虑。其在选定糖尿病成纤维细胞状态中的增加表达提示涉及脂质介质相关信号的额外糖尿病相关转录变化。这些发现表明细胞外核苷酸代谢及相关信号通路相关基因表达的差异，但并未确立细胞外核苷酸浓度或酶活性的变化。此外，与ATP释放相关的基因包括Gja1和Panx1显示出不同的成纤维细胞状态特异性表达谱，表明糖尿病与ATP释放相关基因表达的状态特异性差异相关。糖尿病牙龈成纤维细胞中观察到的细胞外核苷酸代谢及相关信号通路相关基因的变化可能反映代谢疾病、炎症和组织重塑中涉及的更广泛机制，而非糖尿病牙周微环境独有的变化。炎症小体相关基因分析显示Nlrp3和Il1b在各牙龈成纤维细胞状态中总体低表达，同时包括Nek7、Pycard和Casp11在内的基因呈现状态特异性差异。这些模式表明炎症小体相关基因的糖尿病相关转录差异在不同成纤维细胞群体间存在变化。然而，低转录本丰度，特别是Il1b，限制了从这些数据中得出的结论。观察到的表达模式既不能确立炎症小体激活，也不能确定成纤维细胞对成熟炎症小体相关细胞因子产生的贡献。需要蛋白质水平测量和功能测定来评估炎症小体组装、caspase激活和细胞因子加工。研究人员认识到所分析的数据集（GSE188217）每种条件包含一个生物学样本，限制了区分条件相关差异与动物间变异的能力。此外，scRNA-seq测量转录本丰度而非蛋白质丰度、细胞外核苷酸浓度、ATP释放、受体激活或炎症小体活性。未识别到具有足够可比糖尿病vs.对照小鼠牙龈成纤维细胞队列的独立数据集用于外部验证。未来研究纳入独立生物学重复、蛋白质水平测量和功能测定将有助于比较观察到的表达模式并确定其生物学意义。尽管存在这些局限性，本研究为研究糖尿病牙龈中与细胞外核苷酸代谢及相关信号通路相关的基因的成纤维细胞状态特异性变化提供了框架。这些发现促使进一步机制研究以确定特定成纤维细胞状态及相关信号通路是否 contribute to 糖尿病相关牙周炎症，并可能最终为以疾病特异性方式开发细胞特异性治疗策略提供信息。
研究结论部分翻译：研究人员的发现表明，糖尿病牙周炎模型的特征是成纤维细胞以显示炎症状态转录特征为主。此外，本研究识别了与细胞外核苷酸和核苷信号（包括腺苷信号）、ATP释放及炎症小体相关通路相关的基因表达的糖尿病相关差异，这些差异在不同成纤维细胞状态间存在变化。这些发现为进一步研究糖尿病牙龈中嘌呤能信号相关基因表达的成纤维细胞状态特异性变化提供了基础。
