《Plant Biotechnology Reports》：Establishment of a virus-induced gene silencing system to study the effect of glycolate oxidases on oxalate metabolism in spinach
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菠菜是一种营养丰富的叶菜，但其高草酸含量会在食用过程中对矿物质吸收产生不利影响。本研究中，研究人员利用基于烟草脆裂病毒（TRV）的病毒诱导基因沉默（VIGS）体系，探究菠菜乙醇酸氧化酶（SoGLOs）在组织草酸积累中的作用。研究鉴定出一个小型GLO基因家族，并
菠菜是一种营养丰富的叶菜，但其高草酸含量会在食用过程中对矿物质吸收产生不利影响。本研究中，研究人员利用基于烟草脆裂病毒（TRV）的病毒诱导基因沉默（VIGS）体系，探究菠菜乙醇酸氧化酶（SoGLOs）在组织草酸积累中的作用。研究鉴定出一个小型GLO基因家族，并表征了该家族的表达模式以及SoGLO2的亚细胞定位。TRV介导的SoGLO家族靶向沉默降低了多个SoGLO基因的表达，尤其是SoGLO1和SoGLO5，同时伴随草酸积累减少。研究结果为难于通过遗传策略调控草酸积累、改善菠菜营养品质提供了见解。
**研究背景与问题**
菠菜（Spinacia oleracea L.）是广泛栽培的冷季型叶菜，富含维生素、铁、钙、镁、β-胡萝卜素、叶酸和黄酮类物质，但同时积累较高水平的草酸（oxalic acid，一种会抑制钙、铁等必需矿物质膳食吸收的抗营养因子）。草酸可在植物中以可溶性游离酸或不溶性金属草酸盐晶体形式存在，并参与重金属解毒、细胞金属离子调节及抵御食草动物等过程；然而，植物草酸生物合成与分解所涉及的复杂多通路网络尚未被充分阐明。
乙醇酸氧化酶（glycolate oxidase，GLO）是一种依赖黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）的过氧化物酶体酶，在光呼吸（photorespiration）过程中催化乙醇酸和乙醛酸氧化。既有研究对GLO是否参与草酸合成存在分歧：部分研究支持GLO参与某些植物的草酸生物合成，水稻叶片中的研究则显示草酸积累可能不依赖GLO活性。为解析这一机制，研究人员在菠菜中建立并优化TRV-VIGS体系，分析SoGLO家族不同同工型（isoform，由不同基因编码的结构和功能相关蛋白）的表达模式、草酸诱导响应及代表性成员SoGLO2的亚细胞定位，并进一步检验同时沉默SoGLO家族对草酸积累的影响。
**主要技术方法**
供试菠菜品种Viroflay种子来自美国农业部菠菜种质库；样本包括14、28、44日龄叶片以及经3 mM草酸钠处理6 h的2周龄幼苗。研究采用定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析基因表达，以GFP-SoGLO2融合蛋白在本氏烟草表皮细胞中进行瞬时表达和亚细胞定位，经农杆菌浸染构建TRV-VIGS体系，并用草酸诊断试剂盒及显微观察测定草酸和草酸钙晶体。试验设置eGFP阴性对照和SoPDS3阳性对照，并包括两批独立VIGS实验。
**研究结果**
**建立基于TRV的菠菜VIGS体系**
研究人员将SoPDS基因5
′端长540 bp的片段克隆至pTRV2，并以eGFP作为阴性对照。侵染后2、3、4周对接种叶远端新生叶进行qRT-PCR分析，发现TRV2-SoPDS植株中SoPDS转录本较对照降低85%以上，第3周降幅超过90%，第4周约为对照的60%。沉默植株从第2周开始出现白化或褪绿表型，第3周症状扩展至整个茎尖分生组织，第4周在白化叶片及花和生殖器官中仍稳定可见。研究表明，该体系的病毒感染效率超过85%，沉默效率在第3周达到高峰，适用于菠菜基因功能分析。
**乙醇酸氧化酶家族及其表达特征**
研究鉴定出由SoGLO1至SoGLO5组成的5成员GLO基因家族。5个蛋白的氨基酸序列相似性为35%至51%，总体一致性约为20%；保守区域主要位于酶的两端，中央区域差异较大。序列分析在SoGLO1、SoGLO2和SoGLO3的3
′端预测到过氧化物酶体靶向信号（peroxisome-targeting signal，PTS），SoGLO4和SoGLO5中未预测到该信号。GFP-SoGLO2与过氧化物酶体标志物共定位，而未与线粒体标志物共定位，表明SoGLO2定位于植物细胞过氧化物酶体。5个基因均在观察期内（2至6周）的叶片中表达，其中SoGLO2和SoGLO3表达最高，SoGLO5最低；SoGLO1在幼嫩期和成熟期出现表达高峰，开花期下降，SoGLO2与SoGLO3则由幼嫩期向成熟期和开花期升高，SoGLO4与SoGLO5表达相对稳定。外源草酸处理后，5个基因表达均无显著变化，提示未发生由草酸诱导的反馈抑制。
**病毒诱导沉默菠菜SoGLO家族成员**
研究人员分别将5个约500 bp的SoGLO基因片段构建至pTRV2载体，并将5种载体混合后同时侵染菠菜。接种21 d后检测发现，SoGLO1和SoGLO2在所有检测植株中均显著下调；SoGLO3在8株中的5株显著下调；SoGLO5在8株中的7株显著下调；SoGLO4表达未发生变化。部分植株中除SoGLO4外的4个基因同时显著下降。作者指出，SoGLO1、SoGLO2和SoGLO5的沉默效率较高，SoGLO4最低；序列比较未发现5个基因间存在超过21 bp的显著同源片段，因此多基因转录下降来自同时靶向，而非交叉沉默。
**干扰SoGLO降低菠菜草酸浓度**
测定TRV2-SoGLOs与TRV2-eGFP植株的叶片草酸含量发现，沉默植株的总草酸和可溶性草酸浓度均显著降低。显微观察显示，对照组叶片多个区域分布较多草酸钙晶体，而SoGLO沉默植株的晶体明显更少且更小。表达量与草酸浓度的相关性分析表明，SoGLO1、SoGLO3和SoGLO5的表达水平与草酸浓度具有更好的关联。沉默植株未出现明显生长缺陷，仅有与对照相似的轻微病毒感染症状。结果表明，同时沉默SoGLO家族与菠菜叶片草酸积累减少相关，支持GLO介导的代谢参与菠菜草酸生成。
**讨论与结论**
讨论指出，水稻OsGLO1沉默后草酸积累与OsGLO1表达降低未直接相关；考虑到水稻基因组也编码5个GLO，作者认为不同同工型间的功能冗余可能补偿单一或少数同工型的缺失。水稻中稳定RNAi沉默或敲除OsGLO1、OsGLO4会导致明显生长迟缓，而本研究中部分、瞬时的SoGLO下调未造成明显生长障碍，作者将这种差异归因于瞬时VIGS与稳定遗传干扰的作用方式不同。研究同时指出，各GLO同工型在草酸代谢中的具体作用和调控机制仍需进一步解析。
研究结论可译为：综上，研究人员报告了对菠菜SoGLOs调控草酸生物合成生物学功能的初步研究。为便于基因功能分析，研究成功建立并优化了菠菜TRV-VIGS体系；鉴定出小型GLO基因家族，并表征了SoGLOs的表达谱及SoGLO2的亚细胞定位。TRV介导的SoGLO家族靶向降低了多个SoGLO基因的表达，尤其是SoGLO1和SoGLO5，同时草酸含量显著下降，支持GLOs在草酸积累中的关键作用。研究结果提示，GLOs是旨在改善植物性食品营养品质的遗传和农艺策略的有前景靶点；但各GLO同工型在植物草酸代谢中的具体作用及调控机制仍需更详细研究。
