基于流动诱导分散分析（FIDA）的膜蛋白-纳米抗体复合物表征：单位数纳摩尔级亲和力与粒径测定

《Analyst》：Characterization of membrane protein–nanobody complexation via flow-induced dispersion analysis (FIDA)Open Access

　　

纳米抗体（nanobody）结合物可针对膜蛋白靶点开发，应用于调节生物活性及辅助结构解析等诸多领域。流动诱导分散分析（Flow-Induced Dispersion Analysis, FIDA）是一项新兴分析技术，已用于定量蛋白质-蛋白质结合相互作用。FIDA为从亲和力和粒径两方面表征膜蛋白-纳米抗体复合物提供了直接途径。利用FIDA快速表征高亲和力结合膜蛋白的纳米抗体方案，可加速新型基于纳米抗体的生物医药研发，并促进纳米抗体辅助的膜蛋白结构生物学研究。本研究中，研究人员采用FIDA表征了一种纳米抗体与一种模型膜内在蛋白转运蛋白之间的复合物形成。为此，纳米抗体经异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）荧光标记。研究提出了一种简单的两步法方案，用于制备不含干扰性游离染料的标记纳米抗体库存。FIDA实验通过在含去污剂缓冲液中顺序添加胶束化的转运蛋白至标记纳米抗体，揭示了单位数纳摩尔级的结合亲和力，该结果与先前表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）分析获得的结合常数一致。

膜蛋白是药物发现中研究最为广泛的靶点之一，然而其高分辨率结构解析常面临挑战。大分子X射线晶体学（macromolecular X-ray crystallography, MX）需要稳定蛋白及高质量晶体，而冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）则要求靶蛋白分子量超过约40 kDa且结构稳定。这些问题可通过高特异性蛋白结合物——纳米抗体（nanobody）得到缓解。纳米抗体可作为结晶伴侣、冷冻电镜的大体积基准标记物（bulking fiducials）或生物活性调节剂。然而，膜蛋白-纳米抗体复合物的形成通常需要解离常数（dissociation constant, K_d）处于纳摩尔至皮摩尔范围的稳定结合。表征此类复合物的方法包括表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）、生物层干涉（bio-layer interferometry, BLI）和等温滴定量热法（isothermal calorimetry, ITC）等。流动诱导分散分析（Flow-Induced Dispersion Analysis, FIDA）作为一项新兴生物分析技术，可在溶液中直接定量结合亲和力与粒子大小，且样品消耗极低。尽管FIDA已用于可溶性蛋白复合物研究，但其在去污剂溶解的膜蛋白体系中的应用仍较少受到关注，特别是在标准膜蛋白样品中的适用性尚未被充分验证。

为评估FIDA在膜蛋白-纳米抗体复合物表征中的实用性，研究人员以来自嗜热菌Thermotoga maritima的异二聚体ATP结合盒（ATP binding cassette, ABC）转运蛋白为模型膜内在蛋白，以其特异性纳米抗体Nb2为研究对象。研究人员通过FITC标记Nb2，建立了一套不含游离干扰染料的标记纯化流程，并在含十二烷基麦芽糖苷（n-dodecyl-d-maltoside, DDM）去污剂缓冲液中，利用FIDA对两者结合进行定量分析。研究得出以下结论：FIDA测得的ABC转运蛋白-Nb2复合物结合亲和力处于单位数纳摩尔范围（K_d ≈ 9.2 nM），与先前SPR实验所得结果（约1 nM）高度一致；同时FIDA成功测得复合物水动力半径（hydrodynamic radius, R_h）由游离态3.2 nm增至结合态6.3 nm，与基于结构的预测值相符。该研究的重要意义在于证明了FIDA作为一种无需固定化、低样品消耗且快速的均相溶液方法，能够有效表征膜蛋白-纳米抗体复合物，为纳米抗体高通量筛选及膜蛋白结构生物学质控提供了新工具。

研究人员采用的关键技术方法主要包括三方面。第一，流动诱导分散分析（FIDA）：其基本原理是在薄毛细管中于层流（laminar flow）条件下测量分析物分散程度，通过荧光记录随时间变化的信号轮廓，获取R_h值，并通过系列浓度结合伙伴的滴定构建结合等温线以计算K_d。第二，FITC标记与两步纯化方案：利用异硫氰酸荧光素（FITC）对Nb2的多个赖氨酸位点进行标记，随后通过PD-10脱盐柱去除残余游离染料，再经分析型尺寸排阻层析（size exclusion chromatography, SEC）进一步纯化，获得均一的Nb2-FITC（Nb2-F）样品。第三，结合模型选择：针对高亲和力体系，研究人员比较了一比一结合模型与过量指示剂结合模型（excess indicator binding model），后者通过二次方程显式考虑总指示剂与总分析物浓度，适用于高亲和力（单位数纳摩尔至皮摩尔级）膜蛋白-纳米抗体体系。本研究的模型体系来源于前期通过驼类免疫获得的ABC转运蛋白-Nb2复合物，该体系具备共晶结构（PDB 6qv2）及SPR结合常数参考值。

纳米抗体标记与纯化
研究人员通过氨基酸序列分析确认Nb2的互补决定区3（complementarity-determining region 3, CDR3）无FITC反应性赖氨酸，从而预判标记不会显著影响结合。FITC标记后，经PD-10脱盐柱去除大部分游离染料，再经SEC纯化。SEC色谱图显示280 nm与495 nm处存在均一主峰（洗脱体积17.5 mL），后续洗脱峰在21.5 mL处对应未结合FITC。SDS-PAGE经考马斯亮蓝染色及荧光成像证实，纯化后的Nb2-F样本蛋白纯净且不含游离染料，标记比率约为每个Nb2分子结合4个荧光素分子。

水动力半径测定
初始FIDA实验测得游离Nb2-F在10 °C下的R_h值为3.2 nm，与利用HullRad算法基于Nb2晶体结构预测值（约3 nm）相符。当引入ABC转运蛋白后，等摩尔混合物的R_h值增至6.3 nm，最高浓度（100 nM ABC）下为6.9 nm，与基于复合体结构（PDB 6qv2）预测的6.2 nm高度一致，证实FIDA可有效监测膜蛋白结合引起的粒径变化。

结合亲和力与模型拟合
系列浓度FIDA实验构建的结合等温线经拟合显示，若采用标准一比一结合模型，K_d为8.4 nM。鉴于该体系属于高亲和力结合（单位数纳摩尔级），研究人员采用过量指示剂结合模型重新拟合，获得K_d为9.2 nM。该结果略高于SPR测得的约1 nM，但两者均支持紧密的纳摩尔级结合。值得注意的是，一比一拟合在高于K_d浓度区域出现偏离理想S型曲线的现象，而过量指示剂模型更适用于此类高亲和力膜蛋白-纳米抗体体系。

与SPR的比较
SPR实验采用生物素化ABC转运蛋白固定于亲和素包被芯片，而FIDA则在无固定化的均相溶液中完成。两种方法虽原理不同，但均得出单位数纳摩尔级结合亲和力的结论。SPR研究同时考察了ATP结合状态对亲和力的影响，发现游离态与ATP结合态ABC转运蛋白与Nb2的亲和力差异可忽略。本研究的FIDA实验在无ATP条件下进行，与SPR实验缓冲条件一致。

方法学优势与局限
FIDA无需固定化结合伙伴，避免了表面固定、空间位阻或膜蛋白构象改变对结合行为的潜在影响，且样品需求量微克级、实验耗时数分钟，适合高通量筛选。然而，FIDA对弱相互作用的准确测定受限于可配制的配体与膜蛋白浓度上限；同时，其灵敏度依赖于复合物形成引起的R_h显著变化，对于小配体或大分子量靶标可能降低灵敏度。此外，膜蛋白的去污剂或脂质环境、寡聚状态及非特异性吸附亦可能影响分散测量。值得庆幸的是，本研究中FITC标记未阻碍复合物形成，且因Nb2的CDR3区域缺乏赖氨酸，研究人员预计过量FITC标记在多数情况下不会影响纳米抗体与膜蛋白靶标的结合。

本研究表明，FIDA作为一种快速、非破坏性的均相溶液技术，能够高效表征去污剂胶束中膜蛋白与可溶性蛋白结合物（如纳米抗体）的复合物形成。该技术将结合亲和力定量与粒径测定相结合，特别适用于检测纳米抗体的自聚集及多位点结合情况，为膜蛋白靶标质量、稳定性及结构适用性评估提供了有价值的质控信息。研究人员特别指出，鉴于纳米抗体发现过程通常筛选高亲和力结合物，过量指示剂结合模型应作为大多数膜蛋白-纳米抗体体系FIDA数据拟合的首选模型。研究预期，FITC标记配合脱盐-SEC两步纯化的简便方案可广泛应用于未来纳米抗体结合项目，而FIDA技术有望在纳升级样品用量条件下，以分钟级速度实现对高亲和力纳米抗体组合的高通量筛选，从而加速新型基于纳米抗体的生物药物研发及膜蛋白结构生物学研究。