环境响应型电荷反转聚合物构建稳定且pH可激活的三元TiO2纳米复合物用于超声动力学治疗

《Biomaterials Science》：Environment-responsive charge-inversion polymers enable stable and pH-activatable ternary TiO2 nanocomplexesOpen Access

【字体：大中小】 时间：2026年11月02日 来源：Biomaterials Science 6.1

编辑推荐：

　　聚合物-无机杂化纳米材料因其兼具胶体稳定性与环境响应性激活能力，代表了基于超声的无创治疗领域颇具前景的平台。本研究报告了采用合理设计的电荷反转聚合物构建的三元TiO2纳米复合物（nanocomplexes, NCs），该聚合物可在生理温度和弱酸性pH条件下裂解

聚合物-无机杂化纳米材料因其兼具胶体稳定性与环境响应性激活能力，代表了基于超声的无创治疗领域颇具前景的平台。本研究报告了采用合理设计的电荷反转聚合物构建的三元TiO2纳米复合物（nanocomplexes, NCs），该聚合物可在生理温度和弱酸性pH条件下裂解酰胺键。在聚烯丙基胺（polyallylamine, PAA）中引入环己烯基二羧酸酐，使所得聚合物在内体pH范围内具备高效的pH触发电荷反转能力，从而能够在生物相关条件下实现激活。用这些聚合物包覆二元TiO2-PAA复合物，可制备稳定的三元纳米复合物，其在pH 7.4条件下维持负表面电荷，而在酸性条件下转变为正表面电荷。所制备的纳米复合物可被HeLa细胞内化，并表现出时间依赖性的内体逃逸行为，证实了细胞内电荷反转功能在组装状态下仍然有效。值得注意的是，与阳离子二元纳米复合物相比，聚合物包覆显著改善了生物相容性。然而，内体逃逸后的超声辐照可诱导显著的细胞毒性，这可归因于TiO2纳米颗粒在胞质中产生的活性氧（reactive oxygen species, ROS）（如单线态氧；1O2）。这些发现建立了一种材料工程策略，可同时实现细胞外稳定性和细胞内激活，这两者均是设计下一代超声响应生物材料的关键参数。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

超声作为一种无创治疗技术，因其能够穿透深层组织且对正常组织损伤极小，在肿瘤学及其他生物医学领域展现出广阔的应用前景。在超声机械治疗中，声空化、微流和剪切力可破坏细胞结构，这使得超声成为光动力或光热方法难以触及的深部病灶的潜在治疗手段。进一步推进这一策略需要工程化纳米材料能够有效地与声场耦合，并将超声能量转化为具有生物学意义的机械或化学刺激。

二氧化钛纳米颗粒（TiO₂ nanoparticles, TiO₂ NPs）因其化学稳定性、生物相容性以及在声激发下产生活性氧（reactive oxygen species, ROS）或机械扰动的能力，被认为是潜在的超声响应制剂。然而，其实际应用受到生理离子强度或富含蛋白质环境中胶体稳定性差的限制——在这些条件下发生的聚集和蛋白冠形成分别降低了超声响应性和细胞摄取效率。因此，确保纳米颗粒在生物相关介质中的分散稳定性是推进其应用的关键前提。

表面工程是调控纳米颗粒界面性质的有效手段。聚乙二醇和聚乙烯吡咯烷酮包覆可抑制蛋白质吸附并提高胶体稳定性，而聚乳酸-羟基乙酸共聚物和聚多巴胺则可提供控释和内体逃逸等功能。然而，聚合物诱导的稳定化、声响应性和生物学效能之间的关系仍缺乏系统理解。此外，TiO₂ NPs的固有物理化学性质（如晶相、缺陷密度、表面羟基化和带边排列）影响超声触发的ROS产生和机械应力转导，但这些性质与聚合物表面层在超声机械治疗中的相互作用尚未被系统探索。

二、研究内容与核心发现

本研究聚焦于开发聚合物杂化TiO₂纳米复合物（nanocomplexes, NCs），旨在提高胶体稳定性的同时实现环境响应性激活。研究人员采用聚烯丙基胺（polyallylamine, PAA）通过静电杂化增强分散稳定性并促进细胞摄取，但强阳离子表面在生理条件下可引发非特异性相互作用或细胞毒性。为缓解这一问题，研究人员引入第二层刺激响应性聚合物，该聚合物在弱酸性内体pH下发生电荷反转，从而在细胞外稳定性与细胞内激活之间取得平衡。此类电荷反转聚合物在生理pH下带负电荷，但在内体区室中获得正电荷，这些特性有助于内体膜失稳并促进胞质释放。

研究的具体策略是：首先通过静电组装制备二元TiO₂-PAA纳米复合物，再用pH响应的电荷反转聚合物包覆形成三元纳米复合物。研究人员系统考察了所得复合物的物理化学性质，包括内体模拟酸性条件下的电荷转变行为以及细胞摄取特性，并评估了其在培养细胞中诱导超声激活细胞毒性的能力。

三、关键技术与方法

研究人员采用以下主要关键技术方法开展研究：

1.
电荷反转聚合物的合成与表征：将1-环己烯-1,2-二羧酸酐与不同分子量（3000、15000、100000）的PAA反应，通过侧链氨基的羧化反应合成pH响应性电荷反转聚合物（PAA3k-C、PAA15k-C、PAA100k-C），利用¹H-NMR确认完全羧化，并通过监测不同pH条件下溶液透光率随时间的变化评估其pH响应性电荷反转性能。
2.
三元纳米复合物的制备与表征：将TiO₂ NPs与PAA15k通过静电作用自组装形成二元纳米复合物，采用热重分析（thermogravimetric, TG）确定二元复合物组成，再以电荷反转聚合物包覆制备三元纳米复合物，利用动态光散射（dynamic light scattering, DLS）监测粒径和计数率变化，通过Zeta电位测量评估表面电荷特性及pH响应性电荷转变行为，并在人血清白蛋白存在下评估胶体稳定性。
3.
单线态氧产生能力评估：使用单线态氧传感器绿（Singlet Oxygen Sensor Green, SOSG）荧光探针，在超声辐照（1 MHz，25%占空比，1.0 W cm^-2）条件下检测TiO₂ NPs及纳米复合物的¹O₂产生能力。
4.
细胞实验评估：以人宫颈癌细胞系HeLa细胞为模型，采用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记PAA制备荧光标记的三元纳米复合物，通过共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy, CLSM）观察细胞摄取和内体逃逸行为，利用MTT法评估有无超声辐照条件下的细胞活力。

四、研究结果

1. 生理温度下具有电荷反转能力的聚阴离子的合成

研究人员将PAA与邻苯二甲酸酐的反应改为与1-环己烯-1,2-二羧酸酐反应，这一修饰预计可将侧链酰胺键裂解速率提高至三个数量级，使所得聚合物在生理温度（37 °C）下具备pH响应性电荷反转能力。¹H-NMR证实了PAA的完全羧化，不同分子量的PAA均成功合成了相应的电荷反转聚合物。透光率监测显示，所有PAA-C在弱酸性pH下均在一定时间后出现透光率急剧下降（浊点），PAA3k-C和PAA15k-C在pH ≤ 6.0时出现浊点，而PAA100k-C在pH ≤ 6.5时即出现浊点。浊点处侧链酰胺键裂解程度随pH降低而减小。这些结果证实了所合成的聚合物在37 °C下从pH 7.4降至弱酸性pH时可发生电荷反转。

2. 电荷反转聚合物包覆的三元TiO₂纳米复合物的制备

二元纳米复合物的形成通过平均粒径较TiO₂ NPs增大得到确认，TG分析确定其组成为PAA/TiO₂ = 1.87 ± 0.34（重量比）。将二元纳米复合物溶液滴加到电荷反转聚合物溶液中制备三元纳米复合物时，计数率和平均粒径的变化在二元纳米复合物溶液添加量约40–45 μL处出现分界。添加量在40 μL以内时，计数率随添加量增加而增加，平均粒径保持恒定（约250 nm），表明二元纳米复合物被电荷反转聚合物有效包覆形成三元纳米复合物；添加量超过50 μL时，计数率下降且平均粒径增大，表明聚合物量不足以有效包覆，导致聚集和沉淀。在40 μL添加量时，三元纳米复合物中PAA-C/PAA/TiO₂的重量比为1.00/0.83/0.45。

3. 三元纳米复合物的表征

粒径分布和Zeta电位测量显示，二元纳米复合物因表面存在PAA而具有>40 mV的正Zeta电位，经阴离子电荷反转聚合物静电包覆后，Zeta电位变为2 NPs在纳米复合物中仍保持超声诱导的¹O₂产生能力。pH响应性评估显示，使用PAA100k-C制备的三元纳米复合物在pH 7.4下Zeta电位维持在约?25 mV无显著变化，而pH降至5.6后Zeta电位在60分钟内逐渐从?15 mV升高至约10 mV并趋于稳定，归因于电荷反转聚合物侧链酰胺键的裂解导致负电荷减少、正电荷增加。4小时后Zeta电位仍低于二元纳米复合物，表明大部分电荷反转聚合物仍保留在三元纳米复合物上。

4. 三元纳米复合物的细胞内分布与体外声动力学治疗效果

CLSM观察显示，HeLa细胞与FITC标记的三元纳米复合物孵育1和2小时后，绿色荧光与红色荧光（LysoTracker标记的内体/溶酶体）重叠，表明纳米复合物分布于内体中；孵育4和6小时后，绿色荧光数量增加，表明纳米复合物已从内体逃逸至胞质。这一观察证实了三元纳米复合物经内吞摄取后，在内体pH下发生侧链酰胺键裂解（即电荷反转反应）而被阳离子化，通过与内体膜相互作用实现内体逃逸。MTT实验显示，单独超声处理（不添加纳米复合物）时细胞活力约为90%，表明实验超声条件对细胞活力影响极小；添加三元纳米复合物后细胞活力保持在80%以上，证实了电荷反转聚合物包覆显著改善了阳离子二元纳米复合物的细胞毒性问题。然而，内体逃逸后（孵育6小时后）进行超声辐照，细胞活力降至40%以下，这归因于逃逸至胞质的TiO₂ NPs作为声敏剂产生ROS（如¹O₂）导致细胞死亡。此外，单独使用PAA100k-C在较宽浓度范围内（包括5.6 mg mL^-1）无论是否施加超声均未导致细胞活力下降，排除了聚合物本身对细胞毒性的贡献。

五、总结与结论

本研究开发了三元聚合物-无机纳米复合物，兼具胶体稳定性、pH响应性电荷反转和超声触发治疗激活功能。在PAA中引入环己烯基二羧酸酐，合成了能够在生理温度和弱酸性pH下快速裂解酰胺键的电荷反转聚合物，这些性质支持在内体环境中实现高效电荷反转。用这些聚合物包覆二元TiO₂-PAA复合物，获得了稳定的三元纳米复合物，其在pH 7.4下维持负表面电荷，在弱酸性条件下逐渐转变为正表面电荷。所制备的复合物可被HeLa细胞高效内化，并表现出时间依赖性的内体逃逸行为，证实了细胞内电荷反转功能在组装状态下仍然有效。重要的是，三元纳米复合物较阳离子二元纳米复合物具有显著改善的生物相容性；内体逃逸后对细胞进行超声辐照可诱导显著细胞毒性，可能归因于TiO₂ NPs在胞质中产生的ROS。总体而言，本研究提供了一种材料工程策略，可同时实现下一代超声响应生物材料所需的细胞外稳定性和细胞内激活。