通过定制交联剂化学实现PEG水凝胶微球的可编程体内降解

《Biomaterials Science》：Programmable in vivo degradation of PEG hydrogel microspheres through tailored crosslinker chemistryOpen Access

　　

生物材料的可控降解是设计具有确定体内寿命的可注射医疗器械的关键要求。本研究开发了一系列可降解聚乙二醇（PEG）微球（PEG-MS），其以含有不同比例ε-己内酯、丙交酯和PEG的可水解PEG-聚酯三嵌段共聚物为交联剂。通过悬浮聚合合成了五种配方（直径约90 μm）的PEG-MS，并在兔皮内注射后于体外和体内评估其降解行为，组织学评估持续12个月。PEG-MS的降解速率通过调节交联剂组成进行调控，体外降解时间从2周到超过2年，体内从1到6个月。增加己内酯含量和缩短PEG链长可减缓降解，从而建立了交联剂结构与降解行为之间的关系。尽管配方排序保持一致，但体内降解明显快于体外，提示除水解外生物过程亦参与微球降解。组织学分析显示PEG-MS引起以巨噬细胞和多核巨细胞为主的轻度异物反应，无坏死或纤维化包囊证据，随后真皮结构逐步恢复正常。与临床成熟填充剂相比，PEG-MS的组织反应强于交联透明质酸水凝胶，但明显弱于聚酯类胶原刺激剂。此外，PEG-MS可负载丁丙诺啡并在体外实现长达3周的持续药物释放，凸显了该平台的多功能性。总体而言，本研究确定可降解交联剂组成是调控PEG-MS降解的关键设计参数，并证明PEG水凝胶微球的持久性可在广泛时间范围内调控，同时保持其制造工艺、灭菌稳定性和良好的组织相容性。这些发现为合理设计具有定制降解特性的可降解PEG水凝胶微球用于生物医学应用建立了框架。

研究背景方面，可生物降解水凝胶因其高含水量和惰性特征而广泛用于组织工程、伤口愈合、软组织填充和药物递送，目前已有约百种水凝胶产品获监管批准用于临床。现有真皮填充剂主要分为两类：交联透明质酸（HA）水凝胶通过 hydrated 多糖网络的持久性提供容积效果，经酶性和氧化途径逐步降解；胶原刺激型填充剂由可生物降解聚酯颗粒如聚左旋乳酸（PLLA）和聚己内酯（PCL）组成，通过异物反应促进细胞外基质沉积和胶原形成。上述两类材料依赖根本不同的材料结构和降解机制，在实现降解动力学可预测调控的同时最小化慢性组织反应仍是下一代可注射生物材料设计的重要挑战。聚乙二醇（PEG）基水凝胶结合了水凝胶系统的亲水性和生物相容性与合成聚合物的分子设计灵活性，PEG具有低蛋白吸附、有限免疫原性和优异临床安全性。研究人员此前报道了以PEG-聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）三嵌段共聚物交联的可降解PEG微球用于栓塞和药物递送，但这些微球在体内24–48 h内快速降解，未解决交联剂组成如何影响降解行为以及能否实现临床相关时间尺度降解的关键问题。因此研究人员假设系统修改交联剂化学可在保持PEG微球平台水凝胶性质和生物相容性的同时调控降解动力学。

研究人员开展了以下研究：合成含不同比例ε-己内酯、丙交酯和PEG链段的可水解PEG-聚酯三嵌段交联剂，制备五种PEG水凝胶微球配方，进行体外表征，并在兔皮内植入后随访长达一年，同时纳入两种HA填充剂（Restylane?和Juvéderm?）和两种胶原刺激型聚酯填充剂（Ellansé-S?和Sculptra?）作为对照，建立交联剂组成、降解动力学与组织反应之间的结构-降解关系。

主要关键技术方法包括：以PEG（PEG13、PEG4或PEG2）为引发剂、辛酸亚锡为催化剂，通过dl-丙交酯和ε-己内酯开环聚合合成五种可水解三嵌段交联剂（分子量约1600 g mol^?1），甲基丙烯酸酐封端后经¹H NMR确认甲基丙烯酰化程度高于95 mol%；以5% mol交联剂、10% mol 2-亚甲基-1,3-二氧杂环庚烷（MDO）和聚乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯（PEGMA）通过悬浮聚合制备微球，筛分收集50–100 μm组分；采用25 kGy电子束灭菌；体外降解在0.1 M PBS（37 °C）和100 mM NaOH加速条件下以失重法评估；细胞毒性以L929小鼠成纤维细胞系按ISO 10993-5标准培养1周并以BCA法测定总蛋白；动物实验使用18只雄性White New Zealand兔（3.93 ± 0.30 kg），皮内注射后于1周、1/3/6/9/12个月安乐死，进行HES染色组织病理学、ImageJ定量植入物面积与炎症反应厚度及炎症细胞类型比例、抗PEG单克隆抗体E11免疫组化标记；以丁丙诺啡盐酸盐进行载药和体外释放可行性验证（荧光法测定，λ_ex 280 nm，λ_Em 354 nm）。

研究结果如下：在“可水解交联剂的合成与表征”部分，研究人员通过开环聚合成功将丙交酯和递增量的己内酯单元引入PEG13，¹H NMR证实五种三嵌段聚合物（PEG13-LA7-co-CL3、PEG13-LA2-co-CL6、PEG13-CL8、PEG4-CL10、PEG2-CL12）组成与单体投料比相近，甲基丙烯酸酐封端实现端羟基完全转化。在“可降解微球（PEG-MS）的体外表征”部分，通过光学显微镜分析显示所有配方微球呈球形，直径主要在40–140 μm范围，平均91 ± 17 μm，干重百分比18%–28%，冻干和25 kGy电子束灭菌后复水未明显影响外观或直径，交联剂组成对微球分布及灭菌稳定性无影响。在“体外水解降解”部分，PBS中仅PEG-MS-1（20天）、PEG-MS-2（180天）和PEG-MS-3（540天）完全降解，PEG-MS-4和PEG-MS-5即使850天后仅分别失重42%和27%；降解速率随己内酯相对丙交酯含量增加而降低，缩短中心PEG链长进一步减缓水解降解；在100 mM NaOH中所有微球降解时间从1 min延长至203 min，Sculptra?需24 h而Ellansé-S? 6天后仍无可检测降解。在“L929细胞毒性”部分，培养1周后所有配方细胞增殖率高于70%，未观察到PEG-MS降解，表明无细胞毒性浸出物，与合成后洗涤有效去除残留甲基丙烯酸酯单体一致。在“PEG-MS体内降解及与商业填充剂比较”部分，因PEG-MS-1降解过快仅选4种配方植入；18/18只动物全部存活至随访结束；组织学显示PEG-MS-2在7天至3个月快速降解、此后无可见颗粒，PEG-MS-3稳定至1个月、6个月前完全降解，PEG-MS-4和PEG-MS-5植入物面积至6个月消失；植入物面积在1个月（p < 0.0270）和3个月（p < 0.0206）差异显著；单个微球直径植入后快速减小；对照组四种商业材料1年后均保持完整；Juvéderm?和Restylane?植入物面积较大且Juvéderm?随时间增大，Ellansé-S?和Sculptra?植入物面积及颗粒长度基本不变。在“PEG-MS与商业填充剂相关炎症反应”部分，PEG-MS-2和PEG-MS-3炎症反应在1个月达峰、3个月完成降解，PEG-MS-4和PEG-MS-5在3个月达峰后持续下降，6个月时四组间差异显著（p = 0.0153）；炎症反应在所有时间点以巨噬细胞和多核巨细胞为主，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞仅7天时存在；Ellansé-S?和Sculptra?炎症反应厚度逐渐增加、6个月达峰（分别为93和120 μm）后下降，以多核巨细胞为主，Sculptra?后期可见淋巴细胞岛；Juvéderm?和Restylane?炎症反应在1周最大（分别为71和106 μm）后持续下降，Juvéderm?在1个月和9个月显著低于Restylane?（p = 0.0463）。在“胶原形成评估”部分，PEG-MS植入物内胶原面积在所有配方和时间点均较低且不变，Sculptra?类似且更低，其余三种对照填充剂植入物内胶原面积随时间增加、Juvéderm?增幅最大。在“PEG-MS作为药物递送系统的评价”部分，PEG-MS-3通过水中简单混合实现20% w/w载药量和约85%载药效率，冻干和电子束灭菌后丁丙诺啡持续释放约3周，累积释放约39%后达平台，前24 h释放从6%增至14%，爆发强度低。

讨论部分总结：本研究主要目标是确定PEG水凝胶微球降解行为能否通过修改可降解交联剂组成系统性控制，体外与体内结果结合与临床成熟填充剂比较用于建立交联剂结构、降解动力学与组织反应之间的关系。“PEG基微球的可编程降解性”部分指出，该策略区别于传统可生物降解颗粒和交联HA水凝胶填充剂，将亲水性共聚单体PEGMA与引入共价交联网络的可降解聚酯链段结合，通过交联剂组成即丙交酯/己内酯比例和PEG链段长度调控降解动力学，同时保持水凝胶性质；先前以PEG-PLGA交联的PEG-MS在体内24–48 h降解，引入含己内酯交联剂及改变中心PEG长度将兔真皮内降解延长至3–6个月；体外证实降解通过交联剂内酯键水解发生，增加己内酯含量和缩短PEG链长减缓降解，与交联剂更高疏水性和更低吸水率一致，且保持相同制造工艺、粒径分布、灭菌稳定性和组织相容性。“炎症细胞存在下PEG-MS体内降解加速”部分指出，体内降解明显快于体外PBS，提示单纯水解不能解释PEG-MS在真皮中的命运；组织学显示微球直径逐渐减小、水凝胶网络内无细胞浸润、巨噬细胞和多核巨细胞与微球表面紧密关联，周围炎症细胞内检测到PEG阳性物质提示降解产物细胞摄取；文献报道巨噬细胞和多核巨细胞可通过释放酶和活性氧参与生物材料降解，酯解酶如胆固醇酯酶、羧酸酯酶和脂肪酶参与聚氨酯和脂肪族聚酯降解，聚氨酯在胆固醇酯酶存在下降解比缓冲液快十倍，活化炎症细胞产生超氧阴离子（O₂^?）、过氧化氢（H₂O₂）、一氧化氮（NO）和次氯酸（HOCl）可能参与聚合物链断裂和氧化降解；体外降解速率差异明显的四种交联剂植入后差异显著减小，排序保持但降解时间范围缩小，提示可能的细胞外因子作为催化剂加速酯键水解并削弱交联剂组成的影响；交联剂组成仍是降解行为的重要决定因素但受炎症微环境调节，需进一步研究巨噬细胞表型、细胞因子谱、酶活性测定和受控细胞-材料降解模型以确定炎症细胞是否直接参与及水解、酶性和氧化途径的相对贡献，交联密度等其他结构参数也可能通过调节水渗透和生物介质扩散影响降解动力学。“PEG-MS与临床成熟填充剂比较”部分指出，四种商业填充剂提供了解读PEG-MS降解行为和组织反应的有用框架，但因注射剂量、粒径、材料组成、配方结构及Ellansé-S?载体相存在差异，直接比较应谨慎；兔真皮中两种交联HA填充剂引起轻度短暂组织反应，细胞密度12个月内下降，与交联HA水凝胶良好生物相容性一致，两种HA填充剂整个研究期间持续存在与已知临床性能一致；Sculptra?（PLLA）和Ellansé-S?（PCL）引发显著持续异物反应，以含未降解颗粒的巨噬细胞和多核巨细胞为特征，Sculptra?颗粒12个月仍可见，与Lemperle等报道的PLLA微球9个月内降解不同，Ellansé-S? PCL微球（25–50 μm）迅速被多核巨细胞包围吞噬、12个月后仍未降解，与预期一年降解期不符，与巨噬细胞对10–100 μm颗粒通过多核巨细胞降解的尺寸依赖性反应一致；PEG-MS表现出中间生物学特征，组织反应强于HA填充剂但明显低于PLLA和PCL颗粒，未诱导聚酯填充剂周围持续炎症细胞积聚，未检测到提示慢性炎症的淋巴细胞聚集，植入期间逐步降解同时维持适度组织反应，结合了聚酯基系统的可降解性与更接近水凝胶填充剂的组织反应；与传统真皮填充剂组织持久性主要由材料固有性质决定不同，PEG-MS平台允许通过可降解交联剂组成调控驻留时间，体内降解时间1至6个月同时维持适度异物反应和真皮结构逐步恢复。“PEG-MS作为可降解药物递送系统”部分指出，丁丙诺啡载药概念验证显示PEG-MS-3实现高载药量和约3周持续释放，初始爆发强度低与其他可降解丁丙诺啡载药微球相当，约39%累积释放平台与先前快速降解PEG-MS配方中未释放部分与基质降解不完全相关的观察一致，提示降解动力学可根据预期治疗应用定制。“FDA批准的可降解PEG基水凝胶”部分列举了Hydropearl?（栓塞）、SpaceOAR?（放疗期间组织间隔）、TraceIT（组织标记）和Progel?（手术密封剂）等已获监管批准的PEG基可降解水凝胶，证明该类生物材料的转化潜力。“研究局限性”部分指出PEG链段长度和ε-己内酯含量未在所有配方中独立变化，其各自对降解动力学的贡献无法定量区分；微球仅植入真皮单一组织，植入部位对炎症反应和降解速率的潜在影响不可忽视；体内降解机制解释方面组织学观察和体外体内降解显著差异强烈提示炎症细胞参与降解过程，但水解和细胞介导机制各自贡献未详细研究；生物学反应主要通过常规组织学评估，进一步分析炎症细胞群体和组织重塑可提供更多见解。

研究结论翻译：通过使用可水解PEG-聚酯三嵌段交联剂的悬浮聚合，成功制备了球形PEG可降解微球（50–100 μm）。25 kGy电子束灭菌未改变微球尺寸或形态，证实该平台与终端灭菌的兼容性。通过调节可降解交联剂组成，获得了具有可调控降解特性的PEG-MS，将先前报道的PEG-MS配方在兔真皮中的寿命从24–48 h延长至3–6个月。植入研究表明PEG-MS引起以巨噬细胞和多核巨细胞为主的短暂异物反应。微球消失后真皮结构恢复，无持续组织损伤证据，支持该材料良好的生物相容性。与临床成熟填充剂相比，PEG-MS的组织反应强于交联HA水凝胶但明显弱于聚酯类胶原刺激剂。最重要的是，本研究建立了可降解交联剂组成与PEG-MS体外和体内降解行为之间的关系。结果确定可降解交联剂化学是调控PEG水凝胶微球持久性的关键设计参数，同时保持其制造工艺、灭菌稳定性和良好组织相容性。这些发现为合理设计具有定制降解特性的可降解PEG水凝胶微球用于生物医学应用提供了框架。