基于阳离子交换色谱的疏水离子对复合物中蛋白质释放的定量分析

《Analytical Methods》：Quantifying protein release from hydrophobic ion pairs by cation exchange chromatographyOpen Access

疏水离子对（HIP）是一种已确立的小分子和多肽溶解度工程策略，但其向蛋白质的扩展相对研究不足，且在生物相关条件下测量这些复合物中蛋白质释放的定量方法仍然有限。比色法和紫外法测定易受共配制表面活性剂、胆盐和磷脂的干扰。在此，研究人员报道了一种在快速蛋白质液相色谱系统上实施的阳离子交换色谱方法，可在紫外检测前将溶菌酶与这些基质组分分离。按照ICH Q2(R2)进行的验证表明，在20至320 μg mL^?1范围内呈线性（R²为0.9998），检测限为7 μg mL^?1，定量限为20 μg mL^?1，在高离子强度介质中的回收率为88.2%。在含磷脂介质中回收率降至42.6%，限制了这些条件下的绝对定量，但支持对蛋白质释放的比较性评估。将该方法应用于溶菌酶-十二烷基硫酸钠和溶菌酶-二辛基磺基琥珀酸钠复合物，该方法分辨出随pH、离子强度和模拟肠液组分而显著不同的解离行为。溶菌酶-十二烷基硫酸钠在所有条件下均释放可测蛋白质，而更稳定的溶菌酶-二辛基磺基琥珀酸钠复合物抗解离，在大多数模拟肠道条件下释放的溶菌酶低于定量限。回收的溶菌酶保留了天然溶菌酶17–40%的催化活性（取决于解离介质），表明色谱分离能够实现释放蛋白质的定量和功能评估。

**研究背景与问题**

蛋白质治疗药物是增长最快的药物类别之一，目前超过三分之二的畅销药物为生物制品。然而，大多数蛋白质治疗药物仍采用胃肠外给药，因为口服递送受限于胃肠道稳定性差和肠道渗透性低。脂质载体为解决这两大障碍提供了途径，但蛋白质的亲水性限制了其与亲脂性载体基质的相容性，通常需要某种形式的表面修饰才能实现有效包封。疏水离子对（HIP）是一种已确立的溶解度工程策略，其中可电离基团与带相反电荷的两亲性表面活性剂结合，可逆地中和表面电荷并增加亲脂性。该方法在小分子和多肽中已较为成熟，但向蛋白质的扩展尚不成熟。蛋白质表面更大且更不均匀，复合化可能扰动构象和催化功能，所得复合物的表征相应不足。研究人员此前已证明，溶菌酶与十二烷基硫酸钠（SDS）或二辛基磺基琥珀酸钠（DOSS）在确定电荷比下复合可产生亲脂性增加同时保留催化功能的复合物，且这些复合物整合入纳米结构脂质载体时相对于天然蛋白质具有显著改善的包封效率。确定蛋白质HIP复合物是否以及何时释放其货物是制剂设计的核心，但这一测量在最重要之处恰恰变得困难。在简单水缓冲液中，释放的蛋白质可通过比色法定量，但双辛可宁酸（BCA）和Bradford测定易受表面活性剂、胆盐和磷脂干扰，需要额外样品制备。280 nm直接紫外吸收在这些组分存在下缺乏选择性，并受未解离复合物和表面活性剂浊度干扰。反相HPLC提供分离但通常需要有机流动相，可能损害蛋白质结构，且不能可靠地将完整蛋白质与共洗脱表面活性剂分离。据研究人员所知，尚无经过验证的分析方法用于在含表面活性剂和胆盐的介质中定量从HIP复合物释放的蛋白质。离子交换色谱（IEC）通过可逆静电相互作用按净表面电荷分离蛋白质。在低于蛋白质等电点的pH下，带正电荷的蛋白质与阳离子交换树脂结合，随后用递增盐梯度洗脱。在本应用中，阳离子交换色谱将分离和定量整合为单一分析步骤。本研究的目的是开发和验证一种阳离子交换色谱方法，用于在模型解离介质中定量从HIP复合物释放的溶菌酶。该方法按照ICH Q2(R2)进行验证，并应用于表征溶菌酶-SDS和溶菌酶-DOSS复合物在系列pH值、离子强度和模拟肠液组分中的解离行为。通过评估回收溶菌酶相对于天然蛋白质的催化活性，进一步证明了该方法用于下游功能分析的效用。

**关键技术方法**

研究采用?KTA start快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统，配备Frac30馏分收集器和280 nm UV监测器，使用HiTrap? SP HP阳离子交换色谱柱（1 mL柱体积，磺丙基配体，交联琼脂糖基质）。方法开发采用单因子逐一法优化流动相pH（6.0、6.8、7.4）、盐梯度陡度（陡、中、浅）和流速（0.5、1.0、1.5 mL min^?1）。按照ICH Q2(R2)验证特异性、线性、检测限、定量限、精密度和回收率。溶菌酶-SDS和溶菌酶-DOSS复合物以1:1电荷比制备（每分子溶菌酶结合18个表面活性剂分子，蛋白质含量分别为73.4%和64.1% w/w）。解离实验在37 °C、550 rpm孵育6小时后离心过滤进行分析。模拟肠液组分包括NaCl、牛磺胆酸钠和卵磷脂。采用微球菌溶壁活性测定评估回收溶菌酶的酶活性。统计分析使用GraphPad Prism进行双向或单因素方差分析及Tukey多重比较检验。

**研究结果**

**方法开发**：基于溶菌酶的小分子量（14.3 kDa）、高等电点（pI 11.35）和在研究pH下带正电荷的特性，选择阳离子交换色谱模式。在pH 6.8时获得对称峰形（不对称因子1.03，分辨率11.47，保留时间12.13 min）。较浅梯度导致峰变宽和不对称（浅梯度峰宽7.93 mL vs 陡梯度3.91 mL），陡梯度（0–100% B over 10 CV）产生最对称峰且分析时间最短。流速1.0 mL min^?1在色谱性能和分析通量间取得最佳平衡。

**方法验证**：特异性实验表明卵磷脂-牛磺胆酸钠基质在溶菌酶检测窗口无干扰信号，加标溶菌酶峰与纯溶菌酶峰一致。线性范围为20–320 μg mL^?1（R² = 0.9998），检测限7 μg mL^?1，定量限20 μg mL^?1。日内和日间精密度RSD均在预设接受标准内（保留时间≤2%，峰面积≤5%，浓度≤10%）。高离子强度NaCl基质中平均回收率为88.2%（RSD 4.4%），含卵磷脂基质中平均回收率降至42.6%， reproducibility仍可接受（RSD 2.5–3.4%），表明存在系统性基质相关损失，可能源于卵磷脂聚集体存在下的过滤损失。

**溶菌酶-表面活性剂复合物解离定量**：pH和离子强度对溶菌酶-SDS解离有显著影响（双向ANOVA）。在pH 4.0和6.5时，解离随离子强度增加而增加，与钠离子竞争性置换一致。pH 9.0时观察到独特 profile，0.1 M NaCl时最大解离13.9 ± 0.3%，更高离子强度下显著降低（p < 0.0001）。溶菌酶-DOSS在所有条件下绝对解离值极低（最大1.4 ± 0.2%，pH 9.0、1.0 M NaCl），表明其抗解离性显著高于溶菌酶-SDS。

**模拟肠液组分中的解离行为**：溶菌酶-SDS在所有三种模型肠道组分中呈现浓度依赖性解离。NaCl在69至154 mM间显著促进解离（p = 0.00202）。牛磺胆酸钠呈现钟形解离 profile，从3 mM的2.0%增至6 mM的7.3%，12 mM时下降，提示与临界胶束浓度附近的表面活性剂自组装相关。卵磷脂解离随浓度单调增加至1.5 mM时的4.0%。溶菌酶-DOSS在所有肠道组分中解离极小（≤0.5%），蛋白质浓度低于定量限，无法进行统计分析。

**回收溶菌酶的酶活性**：含NaCl馏分中裂解活性随盐浓度增加，与浊度法溶菌酶测定的已知离子强度依赖性一致。含牛磺胆酸钠馏分中活性 profile 大致反映解离趋势，3至6 mM间从697增至1036 units per mL，12 mM（高于CMC）时降至715 units per mL。含卵磷脂馏分中活性随浓度从1540降至880 units per mL，与溶菌酶被包裹于卵磷脂双层片层中物理遮蔽活性位点一致。这些结果证实IEC方法能够回收具有酶活性的溶菌酶用于下游功能评估。

**讨论与结论**

本研究开发并验证了一种阳离子交换色谱方法，用于在含表面活性剂和肠道基质介质中定量分析从疏水离子对复合物释放的溶菌酶。该方法实现了溶菌酶与代表性基质组分的选择性分离，验证工作范围为20–320 μg mL^?1，在所评估条件下精密度良好。基质回收率取决于组成，盐水介质中回收率高，但含卵磷脂介质中回收率显著降低。因此，该方法最适合用于复杂含磷脂基质中蛋白质释放的比较性评估。将该方法应用于溶菌酶-SDS和溶菌酶-DOSS复合物，显示其在pH、离子强度和模拟肠液条件下的独特释放行为，证明了其分辨HIP复合物稳定性差异的效用。重要的是，色谱馏分还可回收用于后续活性测量，将方法从定量扩展到释放蛋白质的功能评估。总体而言，所开发的方法为在常规蛋白质测定受基质干扰的条件下研究疏水离子对复合物中蛋白质释放提供了一种实用的基于分离的策略。