《Chemical Science》：Light-activated, transcription-guided reconfiguration, aggregation, and intercommunication of structurally compartmentalized DNA condensatesOpen Access
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研究人员引入了一种构建光响应微区室化相分离凝聚体作为原细胞模型的多功能概念。该系统展示光触发转录机器激活，诱导微区室化凝聚体的动态可切换或瞬态时空重构、聚集/解聚及互通讯。微区室通过条形码系连的氰尿酸/聚腺嘌呤凝聚层（coacervates）与邻硝基苄基磷酸酯
研究人员引入了一种构建光响应微区室化相分离凝聚体作为原细胞模型的多功能概念。该系统展示光触发转录机器激活，诱导微区室化凝聚体的动态可切换或瞬态时空重构、聚集/解聚及互通讯。微区室通过条形码系连的氰尿酸/聚腺嘌呤凝聚层（coacervates）与邻硝基苄基磷酸酯（o-nitrobenzyl phosphate ester）笼蔽DNA发夹结构竞争性侵入生成，这些发夹结构与展示可变杂交长度、连接条形码系连物的链缀合。光化学去笼使发夹结构形成由转录模板构成的组成型区室（constitutional compartments），或由可重排转录模板组分构成的区室。在T7 RNA聚合酶（T7 RNAp）/核苷三磷酸（NTPs）存在下，相应区室中的转录机器被激活，产生RNA链并信号化微区室的动态重构。通过将RNase H偶联至T7 RNAp/NTPs机器，研究人员展示了微区室的可切换或瞬态重构。此外，通过在一种微区室组分中工程化回文自互补结构域，研究人员展示了微区室的循环切换或瞬态重构，并伴随凝聚体可逆的可切换/瞬态聚集/解聚。并且，通过采用两种经互补条形码系连物修饰的不同微区室化凝聚体，研究人员实现了凝聚体聚集，并伴随辅助转录机器诱导的RNA信号化互通讯及两种微区室化聚集凝聚体的重构。
研究背景与问题：天然无膜细胞器由相分离核酸或蛋白凝聚体构成，其区室化微环境调控转录、转录后过程及细胞器间信号。合成原细胞研究已用脂质体、聚合物囊泡、蛋白质囊泡、树状体、胶体体和水凝胶微胶囊等模拟细胞结构，并在微区室化、类细胞器自聚集、信息传递、区室反应信号、可编程动态网络、融合、分化、形变和迁移等方面取得进展。相分离凝聚体（condensates，相分离形成的无膜微液滴）作为无膜原细胞储库受到关注；条形码功能化氰尿酸/聚腺嘌呤（CA/pA）纤维可凝聚为球状微液滴（MD），不同长度互补侵入链经竞争性扩散跳跃机制实现同心微区室化。转录机器可合成模板编码RNA，是控制凝聚体功能与特异性的重要工具，但原文指出仍存在四类挑战：光触发预定义目标区室中转录模块的时空激活；转录模块/RNase H驱动区室组成的可切换或瞬态重构；将转录/RNase H诱导的组成重构耦合至凝聚体高级功能如动态聚集/解聚；在聚集凝聚体组装体间建立由转录生成RNA作为信息传递链的凝聚体间通讯。研究人员因此将动态光激活转录模块整合入合成凝聚体，以构建模拟天然细胞功能与行为的仿生原细胞组装体。
关键技术与方法（≤250字）：研究人员以条形码Bs1功能化CA/pA凝聚体为母体，通过不同杂交长度侵入链的竞争性侵入构建同心微区室化MD；在侵入链中预置邻硝基苄基磷酸酯笼蔽DNA发夹或转录模板，以365 nm光解笼；以T7 RNAp/NTPs进行体外转录（IVT）产生RNA信号链，并偶联RNase H构建可切换/瞬态体系；设计含回文自互补域f的外缘组分驱动聚集，以荧光共振能量转移（FRET）和共聚焦荧光、聚集计数监测；用互补条形码Bs1/Bs1′修饰两种MD形成W/V聚集体，追踪RNA跨凝聚体通讯。本研究未涉及临床或生物样本队列，凝聚体均为合成体系。
研究结果：（1）负载转录机器的凝聚体合成与微区室化（Synthesis and microcompartmentalization of transcription machinery-loaded condensates）：研究人员将pA-Bs1在CA与PEG-800存在下退火，得到约15 μm条形码功能化凝聚体；用带蓝色荧光的转录模板TMG侵入Bs1形成外缘蓝色区室，T7 RNAp/NTPs在孔雀石绿（MG）存在下转录MG RNA适配体，红色MG-RNA适配体复合物经短Bs1互补序列快速占据空核心，形成蓝/红双区室，说明IVT产生RNA可作为侵入信号。三组分光响应发夹T1/T2/S1按竞争杂交-扩散机制形成J态三区室；365 nm去笼后T1′与T2′-Bs1杂交形成紫色中间区室（K态）并组成完整启动子/转录模板，T7 RNAp/NTPs转录R1置换S1′-Bs1上的淬灭链Q，外部区室绿色开启（L态）。对照缺失完整启动子或未同时光解笼不能重构，表明光解笼是转录驱动重构的必需步骤。
（2）光触发转录机器/RNase H介导微区室化凝聚体的可切换或瞬态重构（Phototriggered transcription machinery/RNase H mediated switchable or transient reconfiguration of microcompartmentalized condensates）：研究人员证实T7 RNAp与RNase H可扩散进入凝聚体。由T3与S3形成M态（空核心、红色内区室、蓝色外区室）；光解S3后T7 RNAp/NTPs转录R2，R2置换S3a′，短侵入链S3a′迁移至核心形成N态；RNase H水解R2后S3a′被S3b′提取回内区室，恢复M态，重复处理实现M?N循环切换。进一步同时加入T7 RNAp/NTPs与RNase H，光激活后M→N中间态约6 h达峰，15 h恢复M；T7 RNAp:RNase H比例控制恢复时间，低RNase H阻止瞬态重构，高RNase H阻止N态形成；NTP浓度升高使转录RNA峰值和耗尽时间增加，说明反向酶催化平衡可实现瞬态/可切换区室重构。
（3）光触发转录机器/RNase介导的可切换或瞬态微区室化重构并伴随凝聚体聚集/解聚（Phototriggered transcription machinery/RNase mediated switchable or transient concomitant reconfigured microcompartmentalization and aggregation/deaggregation of condensates）：O态由空核心、绿色T4-Bs1区室和品红色S4-Bs1外缘组成（S4含Cy3/Cy5 FRET和笼蔽长侵入链）。光解S4后T7 RNAp/NTPs转录R3，R3与D形成R3-D并带短Bs1侵入域移至核心，释放含回文域f的A(Cy5)外缘；A–A自互补桥驱动聚集为P态。RNase H水解R3、释放D，D扩散使A恢复S4′-Bs1双链并解聚回O态；重复T7 RNAp/RNase H实现可切换聚集/解聚，FRET呈OFF-ON（λ
ex/λ
em=548/673 nm），统计显示IVT聚集体平均约16个MD，RNase H后完全分开。同时加入两种酶时，O→P约6 h达峰，随后RNase H降解R3恢复O；比例200:1约9 h恢复，500:1约18 h恢复，绿色T4区室保持不变，表明转录/RNase H可驱动伴随微区室重构的聚集/解聚。
（4）程序化转录机器调控互通讯聚集凝聚体内微区室重构（Programmed transcription machinery-regulated reconfiguration of microcompartments within intercommunication aggregated condensates）：用互补条形码Bs1/Bs1′分别功能化两个CA/pA凝聚体W与V并形成W/V聚集体。W经T1（蓝、短Bs1）与T2（红、长Bs1）侵入形成蓝核红缘；V经S5（FAM/BHQ1、长Bs1′）侵入形成弱绿色外缘。光解笼后W中T1′扩散至外缘与T2′-Bs1杂交成紫色外缘并形成转录模板T1′-T2′-Bs1；V中S5′形成弱荧光S5′-Bs1′外缘。加入T7 RNAp/NTPs后，W转录R4，R4扩散至V并置换S5′，形成R4-S5′-Bs1，使V外缘绿色开启；过程由X态经Y态到Z态。聚集体中R4高浓度通道增强W/V间通讯，较分离W′/V′更有效；W/V虽由互补条形码聚集，但10天内未见渗透和融合，原文认为MD负电荷提供静电动力学屏障。该体系不可逆，原文提出未来可用光响应偶氮苯修饰双链条形码或配体/适配体复合物等实现可逆/瞬态。
讨论与结论总结：该研究把无膜细胞器/相分离凝聚体作为原细胞模型，将笼蔽转录模板整合到微区室化MD中，以光和T7 RNAp/RNase H调控RNA信号，实现区室可切换/瞬态重构、聚集/解聚及凝聚体间通讯；其意义在于从结构仿生推进到信号与动态行为仿生，并推动系统化学。结论还指出未来需整合催化剂于凝聚体内，以离子、光或代谢物触发自主程序化功能，例如整合DNA酶（DNAzyme）实现程序化催化或微液滴复制。
研究结论翻译：由相分离核酸或蛋白凝聚体构成的无膜细胞器是控制细胞功能的关键组分；由紧密区室化微环境组成的细胞器调控多种物理化学细胞功能。例如，核仁、Cajal体和应激颗粒调控生物发生性转录及转录后过程，细胞器间信号在控制细胞转化中起核心作用。该研究引入仿生方法，用合成相分离凝聚体模拟天然细胞器功能；具体而言，研究人员展示了将笼蔽转录模板整合到微区室化微液滴凝聚体中、其光诱导去笼以及触发T7 RNAp/RNase操作转录机器，导致由时产生的RNA链驱动的凝聚体微区室可切换或瞬态重构。此外，通过预工程化凝聚体结构或预工程化凝聚体混合物的结构，研究人员展示了转录引导的凝聚体可切换或瞬态聚集/解聚。除凝聚体聚集/解聚时区室化微环境的凝聚体内重构外，该研究还引入了聚集体内转录调控的互通讯和信号程序化微区室重构。除模拟天然细胞器特征外，该研究通过建立合成转录机器辅助的、调控性的、可切换、瞬态和信号化的细胞样容器结构重构，推进了系统化学领域。尽管已有重要进展，未来仍面临显著挑战；除通过辅助催化剂（酶）实现凝聚体微结构重构外，将催化剂整合到相分离凝聚体中，并通过离子、光或代谢物等辅助剂执行程序化自主功能是可期望的。例如，可设想将DNAzyme整合到相分离凝聚体中，并通过光、离子或氨基酸辅因子触发其激活，用于程序化催化反应或微液滴复制。
