《ChemComm》：Stereochemical engineering of GLP-1 blocks proteolysis while preserving its metal-binding coreOpen Access
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胰高血糖素样肽-1（GLP-1）在生物系统中易被蛋白酶快速降解，限制了其稳定性。本研究证明，通过选择性D-氨基酸取代进行适当的立体化学工程可有效阻断蛋白水解，同时保留肽段固有的金属结合核心。尽管一级结构发生实质性修饰，工程化类似物仍能通过保守配位基序协调金属离
胰高血糖素样肽-1（GLP-1）在生物系统中易被蛋白酶快速降解，限制了其稳定性。本研究证明，通过选择性D-氨基酸取代进行适当的立体化学工程可有效阻断蛋白水解，同时保留肽段固有的金属结合核心。尽管一级结构发生实质性修饰，工程化类似物仍能通过保守配位基序协调金属离子。这些发现揭示了GLP-1金属结合位点的意外稳健性，并表明可在不破坏金属结合功能的前提下增强蛋白水解稳定性。本研究确立了立体化学工程作为一种策略，可在肽系统中将酶稳定性与配位性质解耦。
2型糖尿病（T2DM）以葡萄糖稳态受损和肠促胰岛素效应丧失为特征，即口服葡萄糖无法触发充分的胰岛素反应。人体中调节该通路的两种肠促胰岛素激素为葡萄糖依赖性促胰岛素多肽（GIP）和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）。二者均通过位于胰腺β细胞上的G蛋白偶联受体刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌。除调节胰岛素释放外，GLP-1还降低食欲和食物摄入、增加饱腹感，并调节胰淀素、GABA和Zn(ii)的分泌。尽管具有治疗潜力，天然GLP-1的临床应用因其极短的半衰期（约2分钟）而受限，主要由二肽基肽酶-4（DPP-4）和脑啡肽酶（NEP）介导的蛋白水解降解所致。DPP-4在Ala8和Glu9之间切割GLP-1，而NEP水解中央和C端区域的多个肽键。这种对酶降解的高度敏感性推动了GLP-1受体激动剂（GLP-1 RAs）的开发，包括利拉鲁肽（Victoza?）和司美格鲁肽（Ozempic?）等脂化类似物，其通过白蛋白结合延长血浆驻留时间。然而，这些类似物的肽骨架仍易受蛋白水解切割。改善酶稳定性的一种有前景的策略是引入D-氨基酸，其保留天然侧链化学性质但难以被大多数内源性蛋白酶识别。基于GLP-1中已知的DPP-4和NEP切割位点，研究人员设计了一种新类似物7Dliraglutide，其中第8、15、18、19、27、28和31位残基（相对于GLP-1(7–36)编号）被替换为D-对映体。这些取代与特别易受酶攻击的肽键重合，因此预期在维持GLP-1受体激动剂活性的同时增强对蛋白水解的抗性。锌在葡萄糖代谢和胰腺β细胞功能中发挥关键作用。Zn(ii)离子与胰岛素共同分泌，参与其合成、储存和调节性释放，而锌稳态紊乱与胰岛素分泌受损及T2DM发展相关。锌还具有胰岛素模拟活性，增强糖原合成并抑制糖异生。临床研究进一步表明补锌可改善T2DM患者的血糖控制。本研究纳入铜是因为众多临床观察表明锌和铜稳态之间存在强烈的生理关系，Zn/Cu比值成为与代谢紊乱、氧化应激和葡萄糖失调相关的重要标志物。在此，研究人员比较天然GLP-1、利拉鲁肽及其D-氨基酸类似物7Dliraglutide，以确定立体化学修饰如何影响金属离子配位、结构完整性和蛋白水解稳定性。利用膜模拟环境中的热力学和光谱分析，表征其Zn(ii)和Cu(ii)配合物的稳定性和形态分布，并评估生理相关条件下金属结合对肽结构的影响。
GLP-1、利拉鲁肽和7Dliraglutide的质子化性质及其Zn(ii)和Cu(ii)配合物的稳定性通过电位滴定结合光谱测量进行研究，揭示了GLP-1的8个去质子化常数、利拉鲁肽的7个和7Dliraglutide的11个。GLP-1表现出碱性肽的典型质子化模式，涉及Lys、Tyr、N端胺、His和多个酸性残基。在利拉鲁肽中，Lys的ε-酰化消除了高pKa的Lys步骤，并轻微降低了N端和His的pKa值。相比之下，7Dliraglutide显示出增加的碱性，与电位滴定数据中两个额外解析的Arg残基质子化步骤相关，N端pKa更高，His和Glu残基有适度位移。获得的常数与在可比SDS支持条件下测定的文献值一致。ESI-MS确认仅形成1:1金属-配体配合物。Zn(ii)与GLP-1的结合始于酸性pH下的羧酸根锚定。随后的去质子化步骤涉及Glu残基，随后是His咪唑的配位和N端胺的招募，导致形成组胺样{Nim, NH2}配位基序。在生理pH下，这种结合模式在形态分布图中占主导地位。更高pH下的额外去质子化步骤主要对应于配位水分子或外围侧链，不改变主要供体组。利拉鲁肽遵循密切相关的途径，尽管直接参与配合物稳定的Glu残基较少。然而，近生理pH下的优势物种同样以组胺样{Nim, NH2}螯合物为特征。尽管进行了广泛的立体化学修饰，7Dliraglutide表现出基本相同的配位行为。在初始羧酸根锚定后，His和N端胺被招募形成相同的组胺样结合基序。因此，肽之间的差异主要与外周配体参与相关，而非基本配位基序的变化。Cu(ii)结合对三种肽遵循相似的初始途径。在酸性pH下，金属离子最初由羧酸根供体锚定，随后是His咪唑和N端胺的配位，在中性pH附近产生组胺样{Nim, NH2}配合物。光谱数据通过d–d吸收带的特征性位移支持这一转变。随着pH增加，逐步的酰胺去质子化导致骨架酰胺氮逐渐 incorporation 进入配位球。该过程最终产生以{NH2, 3N?}供体组为主的平面正方形Cu(ii)配合物，与光谱特征和CD数据一致。重要的是，整体Cu(ii)配位途径在GLP-1、利拉鲁肽和7Dliraglutide之间保持保守。尽管立体化学修饰改变了外围质子化平衡，但并未破坏特征性富酰胺Cu(ii)配位核心的形成。GLP-1、利拉鲁肽和7Dliraglutide的Zn(ii)和Cu(ii)配合物的相对稳定性通过基于电位滴定数据的竞争图进行可视化，假设所有组分等摩尔浓度。在酸性pH下，所有三种肽中的Zn(ii)结合均由羧酸根供体引发。GLP-1和利拉鲁肽在pH 2–2.5附近形成第一个可检测的配合物，而7Dliraglutide在略高的pH下开始结合Zn(ii)，可能反映了修饰骨架中Daa-Asp15和Daa-Glu27的取向改变。在近生理pH下，GLP-1和7Dliraglutide显示可比较的Zn(ii)结合，而利拉鲁肽显示较弱的亲和力。CD数据表明螺旋度无显著差异，表明观察到的效应源于局部配位变化。7Dliraglutide中His和N端胺的较大配位诱导pKa位移表明{Nim, NH2}结合基序的更有效组装，而在利拉鲁肽中该基序稳定性较低，导致较高比例的游离Zn(ii)。竞争实验揭示7Dliraglutide对Cu(ii)结合有明显偏好。在该类似物中，His和N端胺的强配位诱导pKa位移表明初始{Nim, NH2}螯合物的稳定化，并通过逐步酰胺去质子化进一步强化，导致热力学稳定的平面正方形4N配合物。GLP-1遵循相同的配位途径，但稳定化程度较低，而在利拉鲁肽中初始O-供体锚定和组胺样中间体均较不利。因此，Cu(ii)被立体化学修饰的7Dliraglutide骨架最有效地稳定化。文献数据表明GLP-1采用部分α-螺旋结构，螺旋段跨越残基14–20和24–35。在pH 7.4下记录的远紫外CD光谱显示特征性α-螺旋信号，在约207和222 nm处有负Cotton效应，在191 nm附近有正带。添加Zn(ii)或Cu(ii)不显著改变GLP-1、利拉鲁肽或7Dliraglutide的CD谱，表明金属配位发生而未破坏肽的天然螺旋骨架。值得注意的是，在利拉鲁肽序列中引入7个D-氨基酸适度改变了其远紫外CD光谱。CD带的轻微位移表明局部构象变化，这可解释肽与其模拟物之间pKa值的差异以及Zn(ii)离子配位的差异。蛋白水解稳定性通过将肽与DPP-4和NEP孵育后经RP-HPLC分析进行评估。这些酶负责体内内源性GLP-1的快速失活，对其作用的抗性对于延长生物活性至关重要。与DPP-4孵育后，GLP-1被快速降解：1小时后，主要片段（P1）占信号的约85%（最可能为(9–36)GLP-1），仅剩约15%完整肽。利拉鲁肽显示更高的抗性，1小时后约82%母体肽保留。相比之下，7Dliraglutide在相同条件下显示完全抗性，即使在1.5小时后也未检测到降解产物，其峰相对强度不变。NEP消化观察到类似趋势。GLP-1被快速降解并在30分钟内消失，产生多个片段。利拉鲁肽部分降解，1小时后约42%完整肽保留。相比之下，7Dliraglutide在整个孵育期间保持完全完整，未检测到新峰。由于白蛋白结合是脂化GLP-1类似物延长循环时间的关键特征，研究人员还检查了引入的D-氨基酸取代是否影响7Dliraglutide与HSA的相互作用。在所应用条件下，顺序结合位点模型提供了数据的最佳描述。该分析表明利拉鲁肽和7Dliraglutide均与HSA相互作用。尽管D-氨基酸类似物对解析的结合事件显示比利拉鲁肽更低的亲和力，但白蛋白结合仍然保留。这些结果表明选择性D-氨基酸取代有效阻断DPP-4和NEP的切割，而天然和酰化L-肽仍易受酶降解。重要的是，这种增强的蛋白水解稳定性在不破坏修饰肽的保守Zn(ii)和Cu(ii)配位基序且不消除其HSA结合的情况下实现。在本工作中，研究人员设计并表征了GLP-1、利拉鲁肽和7Dliraglutide的Zn(ii)和Cu(ii)配合物，7Dliraglutide是一种在已知DPP-4和NEP切割位点含有七个D-氨基酸取代的利拉鲁肽类似物。光谱和电位滴定数据表明所有三种肽采用可比较的α-螺旋结构，并共享保守的组胺样{Nim, NH2}金属结合基序。尽管进行了广泛的立体化学修饰，7Dliraglutide显示与GLP-1可比较的Zn(ii)结合，同时在较高pH下表现出更强的Cu(ii)亲和力，与更有效的富酰胺配位环境形成一致。重要的是，尽管骨架手性部分反转，金属结合核心仍保持保留。蛋白水解消化实验表明GLP-1被快速降解，利拉鲁肽仅部分保护，而7Dliraglutide在DPP-4和NEP处理下均保持完全完整。结合脂化类似物保留的HSA结合，这些结果表明在蛋白酶识别位点的选择性D-氨基酸取代可显著增强蛋白水解稳定性，而不破坏GLP-1基肽的结构和金属结合特征。该策略可能为设计长效肠促胰岛素模拟物和其他在富含Zn(ii)和Cu(ii)环境中操作的肽治疗药物提供通用方法。
