阵列寻址SECCM用于单细胞E-钙黏蛋白/N-钙黏蛋白双标志物电化学谱分析及EMT异质性解析

《Chemical Science》：Array-addressed scanning electrochemical cell microscopy for single-cell dual-cadherin profiling during epithelial-mesenchymal transitionOpen Access

单细胞电化学分析（single-cell electrochemical analysis）为解析细胞异质性提供定量手段，但针对随机分布细胞的传统测量常受靶标搜寻效率低、位置控制有限和统计通量低等问题制约。在此，研究人员报道一种适配体导向、双金属标记的电化学策略，并将其集成于阵列寻址扫描电化学池显微镜（array-addressed scanning electrochemical cell microscopy, SECCM）平台，用于单个细胞两种表面蛋白的靶向分析。研究人员利用微接触印刷（microcontact printing, μCP）的聚多巴胺（polydopamine, PDA）图案，在聚乙烯醇修饰的氧化铟锡（poly(vinyl alcohol)-modified indium tin oxide, PVA-ITO）基底上构建有序单细胞阵列，使SECCM探针能够确定性地定位于预设细胞。研究人员分别用适配体功能化银纳米颗粒（silver nanoparticles, AgNPs）和金纳米颗粒（gold nanoparticles, AuNPs）选择性标记上皮–间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的两个代表性表面标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin, E-cad）和N-钙黏蛋白（N-cadherin, N-cad），产生分离良好的溶出信号用于双标志物读出。以转化生长因子-β₁（transforming growth factor-β₁, TGF-β₁）诱导的A549细胞EMT为模型系统，该平台在单细胞水平定量捕获预期的钙黏蛋白转换：EMT诱导后，E-cad相关电荷由1.49 ± 0.38 nC降至0.23 ± 0.14 nC，N-cad相关电荷由0.26 ± 0.16 nC升至1.01 ± 0.41 nC。双标志物散点分析进一步分辨出上皮样、间质样和杂合E⁺/N⁺表型，揭示整体测量所掩盖的EMT相关细胞异质性。该工作建立了阵列寻址SECCM策略，用于在预设单个细胞上进行基于适配体的E-cad和N-cad双标志物电化学检测，为单细胞表面蛋白谱分析提供通用框架。

研究背景方面，单细胞分析是解析整体平均测量所掩盖细胞异质性的关键分析基础，尤其适用于上皮–间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT；上皮细胞逐步失去细胞–细胞黏附和顶–底极性并获得迁移、侵袭相关间质表型的动态转变）这类不同细胞以不同速率进入中间状态的动态表型转变。EMT的经典分子标志是钙黏蛋白转换，即E-钙黏蛋白（E-cadherin, E-cad）下调和N-钙黏蛋白（N-cadherin, N-cad）上调，因此同一细胞上同时测量E-cad和N-cad可直接区分上皮、间质及中间EMT状态。传统免疫组织化学、免疫荧光成像、蛋白质印迹和定量实时PCR等虽奠定EMT分子基础，但多提供整体平均信息或依赖光学成像解读；整体测量掩盖细胞间异质性，成像方法常需大量标记、图像处理和主观表型分类。电化学生物传感具有灵敏、定量和仪器兼容优势，金属纳米颗粒标签可转化为可区分溶出信号用于多重检测，但多数EMT相关电化学检测仍在细胞群体或随机分布细胞上进行，难以将多个电化学信号以高位置精度归属到确定单细胞。扫描电化学池显微镜（scanning electrochemical cell microscopy, SECCM；利用微/纳米吸管末端受限电解质弯月面在基底上形成局部电化学池的技术）适合单实体电化学分析，但随机分布对象的常规SECCM测量常需盲跳或栅格扫描定位靶标，效率低。细胞图案化可将随机分布细胞转为空间有序、可寻址单细胞阵列，微接触印刷（microcontact printing, μCP）适合生成大面积、几何和间距明确的黏附图案；已有细胞阵列与可编程扫描电化学显微镜集成，但与SECCM集成尚未探索。基于此，研究人员提出适配体导向、双金属标记的电化学策略，并与阵列寻址SECCM平台结合，目标是将SECCM从随机搜寻局部探测转变为阵列寻址单细胞电化学分析平台，对预设单个贴壁细胞上的E-cad和N-cad进行空间配准的双标志物分析。

关键技术方法概括（≤250字）：研究人员以μCP在聚乙烯醇修饰氧化铟锡（poly(vinyl alcohol)-modified indium tin oxide, PVA-ITO）上制备聚多巴胺（polydopamine, PDA）点阵（点径约15 μm、间距100 μm）构建A549单细胞阵列；制备适配体功能化AgNPs（Ag-EBA）和AuNPs（Au-NBA）分别编码E-cad和N-cad；采用阵列寻址SECCM，以约18 μm微吸管和电解质弯月面将反应限制于预设单细胞，进行线性扫描伏安法（linear sweep voltammetry, LSV）检测；A549人肺癌细胞系购自中国科学院细胞库（上海），以TGF-β₁诱导EMT。

研究结果如下。（1）Validation of TGF-β₁-induced EMT in A549 cells as a model system：通过明场形态观察、F-actin染色、E-cad/N-cad免疫荧光和划痕愈合实验，研究人员发现未处理A549细胞呈上皮样铺路石形态，TGF-β₁处理后呈细长纺锤样间质形态，F-actin明显重组，E-cad表达下调而N-cad表达增强，48 h划痕愈合率由12.2%升至56.8%，据此确认TGF-β₁诱导A549 EMT模型成功建立，为评估双表面蛋白特征和单细胞表型异质性提供生物体系。（2）Orthogonal electrochemical readout of E-cad and N-cad using dual nanoparticle probes：通过合成柠檬酸盐包覆AgNPs和AuNPs、偶联硫醇化适配体，并以紫外–可见吸收红移和动态光散射尺寸增加确认Ag-EBA与Au-NBA探针制备；LSV显示Ag氧化峰约+0.06 V、Au氧化峰约+0.9 V，混合探针保持两峰无明显重叠；优化后采用0.8 nM Ag-EBA和0.5 nM Au-NBA，未处理A549细胞呈强Ag峰和弱Au峰，TGF-β₁处理后Ag信号降低、Au信号增强，表明双纳米颗粒探针可将E-cad和N-cad表面变化转化为可区分电化学信号。（3）Construction of an addressable single-cell array for targeted SECCM measurements：通过μCP制备PDA-PVA-ITO点阵，点阵几何均匀，单个PDA点直径约15 μm、中心间距100 μm；A549细胞优先贴附PDA点形成有序单细胞阵列，活/死染色显示高活性；阵列上细胞经TGF-β₁处理后仍出现E-cad下调和N-cad上调，表明该阵列既提供位置可寻址性，又保留细胞活性和EMT相关生物学响应。（4）Array-addressed SECCM for dual-marker single-cell cadherin profiling：通过循环伏安法（cyclic voltammetry, CV）和电化学阻抗谱（electrochemical impedance spectroscopy, EIS）发现PDA-PVA-ITO相较裸ITO氧化还原峰电流降低、电荷转移电阻增加，但仍保持可逆响应，可作工作电极（working electrode, WE）；微吸管内Ag/AgCl准参比电极（quasi-reference counter electrode, QRCE）在3 h内漂移仅?8 mV；以约18 μm微吸管、10 mM KCl电解质弯月面和LSV测量，每组70个单细胞，Q_E-cad由1.49 ± 0.38 nC降至0.23 ± 0.14 nC，Q_N-cad由0.26 ± 0.16 nC升至1.01 ± 0.41 nC；乱序适配体负对照仅见背景水平响应，支持信号归因于特异性适配体–靶标识别；双标志物散点以Q_E-cad=0.46 nC、Q_N-cad=0.39 nC为阈值，未处理细胞91.4%位于上皮样Q4（E⁺/N^?），TGF-β₁处理后82.9%位于间质样Q2（E^?/N⁺），11.4%位于杂合Q1（E⁺/N⁺），少量位于双低Q3（E^?/N^?），表明EMT以异质性而非同步二元转换方式推进；MCF-7中Q_E-cad由2.67 ± 0.43 nC降至0.47 ± 0.21 nC、Q_N-cad由0.16 ± 0.10 nC升至0.82 ± 0.42 nC，支持该策略可拓展至A549以外细胞模型；流式双染结果与电化学测量一致，二者互补；与文献中代表性纳米颗粒细胞表型分析平台比较，该平台的独特之处在于整合单细胞表面标志物分析、空间信息保留和对预设贴壁细胞的直接电化学询问。

讨论与结论部分指出，该阵列寻址SECCM工作流程与流式细胞术互补而非竞争：流式擅长解离细胞的高通量、多参数和成熟分析，而该平台需额外基底制备和探针定位步骤，其分析价值不在于程序更简单、通量更高或标志物容量更大，而在于保留每个测量细胞的空间地址和贴壁基底背景，并实现对预设贴壁细胞的空间配准电化学询问；当前SECCM通量仍低于流式，但阵列寻址设计可通过预设单细胞定位及自动化定位和测量流程实现未来扩展。研究结论翻译如下：该工作开发了阵列寻址SECCM平台，用于单个细胞表面蛋白的靶向双标志物电化学谱分析；通过将μCP定义的单细胞图案化与弯月面限制SECCM测量耦合，该策略使SECCM从随机搜寻局部探测方法转变为阵列寻址单细胞分析平台；预设细胞坐标使SECCM弯月面可重复定位到选定单个细胞，从而提高单细胞电化学测量的位置准确性和测量效率；尽管当前SECCM实施的通量仍低于流式细胞术，但阵列寻址设计可通过预设单细胞定位以及整合自动化定位和测量工作流程实现未来扩展。以TGF-β₁诱导A549细胞EMT为模型系统，适配体功能化Ag和Au纳米颗粒探针将E-cad和N-cad表达编码为两个可区分溶出信号，平台定量捕获预期的EMT相关钙黏蛋白转换，即TGF-β₁刺激后E-cad相关电荷降低、N-cad相关电荷升高；更重要的是，双标志物单细胞分析分辨出异质性表型状态，包括整体平均测量所掩盖的杂合E⁺/N⁺细胞。在当前概念验证中，E-cad和N-cad作为代表性双标志物对；更广泛的生物标志物覆盖原则上可通过改变相应识别配体并引入额外电化学可区分标签实现，但此类更高阶多重检测仍需进一步实验验证。总体而言，该工作建立了基于适配体的双标志物电化学策略，用于可单独寻址贴壁细胞表面蛋白谱分析，并为异质细胞系统中空间配准的单细胞电化学分析提供框架。