低亲和力可交换探针用于超分辨与长期荧光成像

《Chemical Science》：Low-affinity exchangeable probes for super-resolution and long-term fluorescence imagingOpen Access

　　

为了克服基于共价键或强探针-靶标相互作用的传统荧光标记方法的局限性，低亲和力标记近年来作为一种有吸引力的替代方案而兴起。由于探针在标记位点快速交换，该方法规避了两大挑战：它能够实现近乎无限的标记并最小化光漂白，同时为探针的开/关切换提供简单机制，这对超分辨成像至关重要。本综述涵盖了针对生物靶标的主要低亲和力探针类别。第一大类基于荧光团与其靶标之间的锁钥相互作用，例如生物膜、RNA适配体、蛋白质标签和内源性生物分子。在这些体系中，染料-靶标复合物的形成通常诱导荧光响应，使得即便存在大量未结合探针也能实现低背景成像。第二类依赖于特异性识别生物靶标的荧光标记配体。主要示例是DNA-PAINT，它利用短荧光标记寡核苷酸与其附着于靶标特异性载体上的互补序列进行可逆杂交。新兴方法还采用肽、蛋白质、核酸适配体和小分子作为低亲和力配体。低亲和力标记已能实现低至约1 nm的分辨率成像，但其速度仍较慢且主要适用于固定细胞。研究人员预计，该领域将持续快速发展，一方面得益于荧光染料设计的新概念和可逆标记策略，另一方面则源于其在先进荧光显微镜中日益增长的应用范围。

论文主体内容总结

1. 引言

传统的荧光标记和成像主要依赖共价或高亲和力标记，这些方法因标记与生物分子间的牢固连接而稳健，但在应用于先进荧光显微术时遇到瓶颈。首先，荧光团会发生光漂白并产生活性氧，导致生物分子只能被监测有限时间，长期观察会引起信号损失和光毒性。尽管已有多种提高光稳定性的方法，如使用还原氧化试剂和猝灭剂等，但单分子在光漂白前所能发射的光子数物理上限极少超过10⁶个。另一方面，单分子定位显微术虽能实现纳米级乃至埃级分辨率的超分辨成像，但系统性地需要染料具备开/关切换能力，这对经典染料而言颇具挑战。一种完全不同的解决思路是用可逆的低亲和力标记取代共价标记。此时探针不再永久附着于靶标，而是在测量过程中可逆结合。低亲和力意味着高解离速率，确保同一分子在结合位点停留有限时间；同时结合速率应足够高以保证新分子的快速替换。由于探针可在结合位点持续更新，理论上可实现“永恒”标记。此外，可逆结合可直接关联到染料结合靶标时的开/关切换及其定位，可用于超分辨成像。2006年提出的PAINT技术即利用了尼罗红这一荧光和溶剂化显色染料的动态结合-解离特性。该原理后被扩展至DNA-PAINT等多种体系。总体而言，可交换探针的发展构成了化学生物学中一个快速扩张的研究方向。

2. 低亲和力标记：原理

低亲和力可交换探针由荧光染料和靶向基团组成，其特点是高特异性但弱可逆结合。现有可交换探针可分为基于荧光团识别和基于配体识别两大类，前者中荧光团本身充当识别配体，后者则使用与荧光团偶联的专用识别配体。基于荧光团识别的探针包括与脂质膜相互作用的类型，如尼罗红对膜的亲脂性；与工程蛋白标签相互作用的类型，如FAST蛋白标签和基于HaloTag支架的非共价结合配体；以及与RNA适配体特异性可逆相互作用的类型。基于配体识别的探针主要通过DNA杂交原理实现低亲和力标记，即DNA-PAINT，其中标记特异性由碱基配对保证，低亲和力通过缩短互补链长度来实现。该方法常与抗体结合使用，并已扩展至纳米抗体、适配体、FISH方法以及DNA-脂质偶联物等。新兴策略还包括使用肽和蛋白质片段，如Fab结构域和卷曲螺旋相互作用，以及小分子支架作为可逆标记的特异性配体。低亲和力标记通常依赖两类荧光团：基于配体的策略常用始终开启的经典荧光团；而基于荧光团-靶标识别的方法则常使用环境敏感型染料，其发射强度或颜色随结合事件而变化。所有瞬时标记方法面临共同目标与挑战：高特异性、可调亲和力、高亮度、最小化背景、最小化光漂白与光毒性、荧光/显色响应、原子经济性、活细胞兼容性以及简便快速且成本效益高。

3.1 超分辨成像

荧光显微术受衍射限制，常规横向分辨率约200 nm。超分辨显微术的出现突破了这一障碍。宽场纳米镜因其基于单分子检测与定位的原理而广受欢迎，它通过控制仅激活少量荧光分子，实现纳米级精度的定位。低亲和力可交换探针被用于实现PAINT技术，其所需的闪烁并非来自固有光开关，而是源自探针的瞬时结合。PAINT巧妙解决了两个持久局限：不严格要求光开关探针，且对光漂白具有鲁棒性，因为单个染料分子漂白后会被溶液中完好的探针持续替换，从而实现“准无限”染料储备。PAINT高度模块化，可根据可逆结合类型分类，衍生出DNA-PAINT、glyco-PAINT、peptide-PAINT等多种变体。PAINT还具有极高的分辨率潜力，可达埃级尺度，并天然支持重复多重成像。此外，通过记录光谱参数可引入额外维度，如光谱分辨PAINT实现了纳米尺度的疏水性和脂质组织映射。分子扩散和取向的记录也提供了细胞膜生物物理性质的重要信息。PAINT也存在特定实验约束，包括背景管理、合适的动力学区间选择等。

3.2 长期成像

长期常规荧光成像对于捕捉跨越分钟到小时的生物学过程至关重要。共价有机荧光团标记虽简单直接，但受光漂白的根本限制，会导致不可逆信号损失，且伴随活性氧产生引发光毒性。低亲和力探针通过可逆结合提供了一种优雅的解决方案：探针从周围溶液中持续供应，结合、发光、可能漂白、解离并被完整分子替换，使信号不再受限于单个染料的漂白时间。早期荧光团激活蛋白确立了暗染料仅在结合时才显著变亮的概念。FAST/Y-FAST方法提供了小型基因编码标签，与细胞渗透性荧光团形成明亮复合物并快速解离，使标记完全可逆且可调。化学遗传标签与探针交换也得以开发，通过染料可逆占据疏水口袋提供荧光信号并从溶液更新以维持更长成像。基于HaloTag技术的两种互补方法现可实现染料更新：逆向工程HaloTag改善荧光底物周转，完全非共价的可交换HaloTag配体允许瞬时结合并减少长时间采集中的光漂白。降低荧光团亲和力本身也可成为一种优势。低亲和力可交换探针还在扫描式高分辨方法中找到应用，如在STED中通过连续替换光漂白荧光团实现长时间稳定的三维多色活细胞成像。整体而言，这些研究表明瞬时低亲和力标记可通过减少光漂白显著延长高分辨实验时间，前提是精确控制动力学、浓度和背景。