离体评估咖啡因和α-生育酚在人类和猪皮肤中的递送：共聚焦拉曼光谱和Franz扩散池/HPLC分析

《International Journal of Pharmaceutics》：Ex vivo assessment of caffeine and α-tocopherol delivery to human and porcine skin: confocal Raman spectroscopy and Franz diffusion cell/HPLC analysis

•制备了含有咖啡因和α-生育酚的稳定分散体。
•共聚焦拉曼光谱法能够对离体皮肤中的两种活性成分进行深度分辨分析。
•人体皮肤与猪皮中的拉曼深度剖面存在差异。
•咖啡因的拉曼深度剖面比α-生育酚更清晰。
•拉曼剖面分析与HPLC分析为皮肤递送提供了互补信息。

引言

由于皮肤作为有效的保护屏障，生物活性化合物的局部和真皮递送仍然具有挑战性。角质层（SC）由嵌入高度有序脂质基质中的角质细胞组成，限制亲水性和亲脂性分子的渗透，并限制它们进入更深的活性皮肤层和区域。这种屏障功能对于设计用于运输固有不同理化性质化合物的联合递送系统尤为重要。在此类系统中，制剂设计不仅需要解决单个活性成分的递送问题，还需要解决它们在皮肤组织内的同时分布问题（Gorzelanny等，2020；Lunter等，2024；Zhao等，2024）。

咖啡因（CAF）和α-生育酚（TOC）在皮肤科和化妆品应用中均具有价值，尽管它们在极性、溶解度和预期的皮肤分布行为方面存在显著差异。CAF是一种相对较小的亲水性分子，常用于局部制剂，由于其抗氧化、抗炎和血管收缩特性，已被研究用于各种皮肤相关应用（Watts等，2024；Albayati等，2026）。其理化性质和独特的拉曼光谱特征也使其成为研究皮肤渗透和皮肤内深度分辨分布的有用模型化合物（Franzen等，2015；Elias等，2023；Steiner等，2024）。

相比之下，TOC是一种高度亲脂性的抗氧化剂，有助于保护皮肤脂质和细胞结构免受氧化应激（Lopez-Torres等，1998）。然而，其较差的水溶性和对富脂环境的强亲和力使其均匀掺入常规水性局部制剂中具有挑战性。由于其亲脂性，TOC也可能优先积聚在SC和上层皮肤富含脂质的区域，而不是均匀分布于整个组织（Keen和Hassan，2016）。因此，CAF和TOC的联合递送高度依赖制剂且具有挑战性，需要能够同时容纳亲水性和亲脂性成分，同时促进其在所需皮肤区域释放和沉积的载体系统。

基于脂质的囊泡系统已被广泛研究作为局部和真皮递送的载体。其中，可变形囊泡分散体特别具有吸引力，因为它们的双层性质可以通过掺入边缘活化剂、乙醇或其他增加膜柔韧性、改变囊泡-皮肤相互作用并促进与皮肤表面接触的成分来调节。实例包括类转移体、类醇脂体和类传递醇脂体分散体（Ascenso等，2015；Richard等，2021）。它们的递送性能受多种制剂参数影响，包括囊泡大小、层状度、脂质组成、膜修饰剂类型、溶剂含量、双层变形性和表面电荷。特别是，使用具有不同离子特性的边缘活化剂和双层成分可以产生具有中性、负或正表面电荷的囊泡，从而可以研究电荷对囊泡-皮肤相互作用的影响（El Zaafarany等，2010；Opatha等，2020；Guillot等，2023）。带正电荷的囊泡可能与带负电荷的皮肤成分发生更强的相互作用，可能增强表面粘附或滞留。同时，带负电荷的囊泡可能根据边缘活化剂的化学性质与脂质基质相互作用，而中性系统可能与带电荷的皮肤域发生静电相互作用（El Zaafarany等，2010；Dragicevic-Curic等，2010；Miatmoko等，2022）。

评估真皮递送系统需要能够解析化合物在皮肤内分布的方法。使用Franz扩散池（FDCs）的常规研究提供了关于化合物转运至受体相的有价值信息，并结合组织提取，提供关于总皮肤沉积的信息。然而，这些方法通常需要破坏性样品处理，并且对SC和活性皮肤层内化合物的深度依赖性定位提供的信息有限（Binder等，2018；Pulsoni等，2022）。

共聚焦拉曼光谱（CRS）提供了一种互补的、无标记的分析方法，用于对皮肤和外源性化合物进行化学深度剖析，而无需荧光或放射性标记（Binder等，2018；Krombholz和Lunter，2020；Lunter等，2022）。通过在不同深度收集拉曼光谱，CRS可以提供关于局部应用物质在SC和下层活性皮肤层内相对分布的信息。专用软件工作流程，如带有绝对定量选项的RiverD SkinTools（Caspers等，2019），进一步促进光谱预处理、皮肤表面检测、深度对齐和化合物特异性剖面分析（Krombholz和Lunter，2020；Lunter等，2022；Steiner等，2024）。

这种方法对于CAF和TOC的联合递送尤为重要，因为CRS能够研究同一皮肤模型中化学性质不同的外源性化合物，前提是它们的光谱特征可以与内源性皮肤背景区分开来（Franzen等，2015；Krombholz和Lunter，2020；Steiner等，2024）。这一点尤其重要，因为亲水性和亲脂性化合物不太可能表现出相同的渗透和沉积模式。CAF可能表现出依赖于水合作用在SC和下层活性皮肤层中的分布，而TOC由于其亲脂性，预计会与富脂皮肤区域更强烈地结合。因此，同时进行深度剖析可以提供关于囊泡分散体是否支持两种化合物的共同递送或导致不同沉积模式的见解。

猪皮被广泛用作人类皮肤的离体模型，因为其在厚度、脂质组织和屏障特性方面具有相似性。然而，形态学、附属器密度、脂质组成、解剖来源、供体变异性、储存条件和样品处理方面的种间差异可能会影响渗透结果（Barbero和Frasch，2009；Jung和Maibach，2015；Kocsis等，2022；Keck等，2022）。因此，猪皮为制剂筛选提供了实用且可重复的模型，尽管当预期应用是皮肤科或化妆品时，在人类皮肤中的确认仍然很重要。使用相同的拉曼剖析工作流程直接比较猪皮和人类皮肤，可以提供关于在猪模型中观察到的依赖于制剂的趋势是否可以转移到人体组织的有价值信息。然而，解决这一问题的比较性CRS数据仍然相对有限，只有少数研究直接比较了猪皮和人类皮肤中的渗透剖面（Choe等，2015；Krombholz等，2022a；Krombholz等，2022b）。

本研究旨在研究CAF和TOC从含有不同膜修饰剂的基于磷脂酰胆碱的囊泡分散体中的皮肤递送，从而产生具有不同表面特性的系统，包括近中性、带负电荷和带正电荷的系统。制剂的表征包括粒径分布和Zeta电位，其递送性能随后使用互补的离体方法进行评估。通过常规分析评估在FDCs中孵育后猪皮中的化合物分布，而非侵入性CRS结合RiverD SkinTools应用于猪皮和人类皮肤，以提供CAF和TOC分布的深度分辨信息。

本研究基于以下假设：囊泡组成差异可能影响亲水性CAF和高亲脂性TOC的皮肤分布。因此，主要目标是确定组成不同的制剂是否可以调节两种共配制的化合物在离体皮肤中的深度依赖性分布。次要目标是检查在猪皮中观察到的依赖于制剂的分布趋势在人类皮肤中是否在相当的CRS暴露条件下也明显。

本研究的一个独特方面是将深度分辨CRS与常规FDC实验、组织提取和HPLC分析相结合，提供不同空间尺度上化合物分布的互补信息。此外，猪皮和人类皮肤之间的比较为猪皮作为评估用于局部应用的囊泡制剂的离体模型的潜在转化相关性提供了见解。

材料与方法部分

材料

聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯（Tween 80，T80）、脱氧胆酸钠（SDC，≥98%）、二甘醇单乙醚（DEGEE，≥9%）、α-生育酚（TOC，≥96%）和咖啡因（CAF，≥98%）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。大豆L-α-磷脂酰胆碱（SPC，≥95%）和1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷（DOTAP，≥99%）购自Avanti Polar Lipids（美国阿拉巴马州阿拉巴斯特）。分析级有机溶剂购自VWR International（美国宾夕法尼亚州拉德诺）。所有

理化表征与胶体稳定性

负载CAF和TOC的分散体的理化特性总结于表2。所有制剂均表现出纳米级的平均流体动力学直径，范围约为75至100 nm。SPC/T80显示出最小粒径（75–77 nm），其次是SPC/DOTAP（约85 nm）和SPC/SDC（约100 nm）。SPC/T80和SPC/SDC表现出狭窄的粒径分布，PDI值为0.06–0.11，而SPC/DOTAP表现出更宽的分布，值为0.21–0.23。将pH从7调

结论

本研究表明，电荷调节的磷脂分散体可以在单一局部递送系统中共同配制CAF和TOC，其皮肤分布反映了活性化合物和制剂组成。研究结果表明，深度剖面取决于化合物和制剂，但在近中性、阴离子和阳离子制剂之间未出现一致的排序。因此，在解释皮肤递送时，名义表面电荷应

CRediT authorship contribution statement

Adam Srnec：写作——初稿、可视化、方法学、调查、形式分析、概念化。Jakob Schmolz：方法学、调查。Tanja Pfleger：调查。Diana Cerbu：方法学、调查。Christian Freyst?tter：资源。Adelheid Elbe-Bürger：写作——审阅与编辑、资源、方法学。Lucie Urbánková：监督、概念化。Věra Ka?párková：写作——审阅与编辑、监督、方法学、概念化。Victoria Klang：

利益冲突声明

作者声明，他们已知无可能影响本研究报告工作的竞争经济利益或个人关系。

致谢

本工作得到了捷克科学基金会（项目号GA25-17718S）、由捷克共和国教育、青年和体育部资助的聚合物系统中心内部开发项目DKRVO RP/CPS/2024-28/001以及TBU在兹林内部资助IGA/CPS/2026/001（由特定学术研究资金资助）的支持。

Adam Srnec|Jakob Schmolz|Tanja Pfleger|Diana Cerbu|Christian Freyst?tter|Adelheid Elbe-Bürger|Lucie Urbánková|Věra Ka?párková|Victoria Klang