《CrystEngComm》：Solvates under stress: mapping stability and desolvation pathways in daprodustatOpen Access
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本研究对达普司他（daprodustat，DAP）中溶剂化物（solvate）的形成进行了全面考察，特别关注湿度与温度驱动的相变以及去溶剂化（desolvation）过程中新相的出现。广泛的固态筛选（solid-state screening）揭示了一个丰富的
本研究对达普司他（daprodustat，DAP）中溶剂化物（solvate）的形成进行了全面考察，特别关注湿度与温度驱动的相变以及去溶剂化（desolvation）过程中新相的出现。广泛的固态筛选（solid-state screening）揭示了一个丰富的固体形态图谱，包括三种无水晶型（forms I–III）和24种溶剂化物，其中包含九种此前未报道的溶剂化物形式。所有溶剂化物均经过了全面表征。此外，研究人员采用虚拟筛选（virtual screening）确认了DAP具有高度的溶剂化物形成倾向。尽管所有溶剂化物最终均去溶剂化形成晶型I，但观察到了不同的转变路径。若干溶剂化物表现出湿度和温度依赖性的中间相（intermediate phases），据此可分为两类：直接去溶剂化的溶剂化物和形成中间溶剂化物相的溶剂化物。这些路径通过变温粉末X射线衍射（variable-temperature powder X-ray diffraction，PXRD）和红外光谱（infrared spectroscopy）加以阐明，并辅以热重分析（thermogravimetric analysis，TGA）以及变湿度PXRD（variable-humidity PXRD）。值得注意的是，二甲基甲酰胺（dimethyl formamide，DMF）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）和四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）单溶剂化物（monosolvates）在高相对湿度（relative humidity，RH）下可重复地转化为稳定的半溶剂化物（hemisolvates），随后较缓慢地转变为晶型I。相反，吡啶（pyridine，Pyr）溶剂化物表现出优异的稳定性，在25 °C和80% RH条件下经由低溶剂化物中间体逐渐转化，并最终在加速胁迫条件下转变为晶型I。这些发现凸显了系统绘制溶剂化物形成及去溶剂化路径对于指导工业加工策略的重要性。此类认识有助于设计稳健的干燥和储存条件，并指导溶剂选择，以规避有问题的溶剂化物或利用那些能够可靠转化为目标多晶型的溶剂化物。
研究背景：活性药物成分（active pharmaceutical ingredient，API）的固态形式选择在药物开发过程中至关重要，因其可显著影响生物利用度、溶出行为、长期稳定性或可制造性。多晶型（polymorphs）、溶剂化物（solvates，包括水合物）或其他多组分体系（如共晶或盐）可表现出显著不同的性质。因此，需要进行广泛的固态筛选（solid-state screening），不仅识别热力学稳定形式，还需识别亚稳和瞬态形式以及转变路径，从而实现稳健的工艺设计并防止放大和储存过程中出现意外的相行为。溶剂化物因其在标准结晶溶剂中结晶时易于形成而构成特殊挑战，需要详细表征以及在可能的制造条件下研究去溶剂化（desolvation）路径。不同的温度和湿度条件可能导致结构相似的去溶剂化物、其他方式难以获得的多晶型、无定形物质或中间体（如低化学计量比溶剂化物）的出现。因此，了解溶剂特异性行为对制药工业至关重要。达普司他（daprodustat，DAP）是一种小分子可逆性缺氧诱导因子脯氨酰羟化酶抑制剂，用于治疗接受透析的成人慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）所致贫血。DAP属于生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system，BCS）II类药物，于2020年在日本首次获批，2023年获美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市，商品名为Jesduvroq。DAP具有丰富的专利固态形式图谱，已报道的多晶型包括forms CS1、CS9、M、K、1–4、C1、C2和C4，以及多种溶剂化物、离子共晶和无定形固体分散体。此前的工作尚未系统绘制去溶剂化路径，尤其是温度和湿度驱动的转变，而这些对放大过程可能至关重要。为弥补这些空白，本研究结合了系统的实验固态筛选与溶剂化物稳定性和去溶剂化行为的详细研究。
研究人员开展了以下研究：通过溶剂蒸发、冷却结晶、有机溶剂浆液法、反溶剂结晶、溶剂蒸气扩散和受控条件下去溶剂化等多种结晶技术，对DAP的固态形式图谱进行了全面筛选。实验筛选鉴定出DAP为高产的溶剂化物形成者，在42种受试溶剂中有17种形成了溶剂化物。研究人员在四种特定温度和相对湿度条件下评估了DAP溶剂化物的稳定性：环境条件（室温，20% ± 6% RH）、加速储存条件（40 ± 0.1 °C，75 ± 2% RH）、干燥条件（室温，0% RH）和潮湿条件（室温，100% RH）。通过粉末X射线衍射（PXRD）在预定时间点监测固态形式。此外，研究人员采用原位变湿度PXRD（VH-PXRD）监测选定溶剂化物的湿度驱动转变，采用变温PXRD（VT-PXRD）和变温红外光谱（VT-FTIR）结合热重分析（TGA）和差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）研究温度驱动的去溶剂化路径。热台显微镜（hot-stage microscopy，HSM）用于观察热诱导的去溶剂化和相变过程。研究人员还采用多组分氢键倾向性（multi-component hydrogen bond propensity，MCHBP）工具进行虚拟溶剂化物筛选。
主要关键技术与方法：（1）多种结晶技术进行固态筛选，包括溶剂蒸发、冷却结晶、浆液法、反溶剂结晶和溶剂蒸气扩散；（2）在四种受控温度/湿度条件下进行系统性去溶剂化研究，通过PXRD定期监测；（3）变温PXRD（VT-PXRD）和变湿度PXRD（VH-PXRD）原位监测相变；（4）变温FTIR光谱（VT-FTIR）；（5）热重分析（TGA）和差示扫描量热法（DSC）联用（STA）确定化学计量比和热事件；（6）热台显微镜（HSM）观察热诱导去溶剂化；（7）MCHBP计算工具进行虚拟溶剂化物筛选。DAP原料药购自ChemExpress（中国），经确认由晶型I组成；所有溶剂均为分析纯。溶剂化物放大采用浆液法，以约500 mg DAP晶型I为起始物料，温度在10至30 °C之间持续循环搅拌，例外为S-DEE和S-iPrOHI在3.8至5.6 °C之间循环搅拌制备。
研究结果：
3.1 溶剂化物筛选与系统去溶剂化研究
通过溶剂蒸发、冷却结晶、有机溶剂浆液法、反溶剂结晶、溶剂蒸气扩散和受控条件去溶剂化等技术，共鉴定出24种溶剂化物（含此前工作），其中包括九种新型溶剂化物。发现三种此前未报道形成DAP溶剂化物的溶剂，产生了四种新型溶剂化物：S-tAmOH、S-EtEtOH以及两种不同化学计量比的吡啶溶剂化物（S-PyrA和S-Pyr0.5）。发现了异丙醇和1,4-二氧六环的新型溶剂化物多晶型（分别为S-iPrOHII和S-DXII）。此外，还发现了DMF、DMSO和THF的不同化学计量比溶剂化物（分别为S-DMFA、S-DMSO0.5和S-THF0.5）。部分此前被描述为多晶型的DAP固态形式被鉴定为溶剂化物：form 2为甲醇溶剂化物（S-MeOH），form 3为乙苯溶剂化物（S-EB），form 4为乙醚溶剂化物（S-DEE）。共对14种DAP溶剂化物进行了系统去溶剂化研究。在环境条件下，大多数DAP溶剂化物在60天研究期内保持稳定，例外为S-DMFA、S-DMSO1、S-tAmOH和S-MtBE。S-DMFA被发现在环境条件下极不稳定，首先转变为单溶剂化物S-DMF1，然后转变为半溶剂化物S-DMF0.5。S-DMSO1也去溶剂化为半溶剂化物（S-DMSO0.5），但过程较慢。在加速储存条件下，多种溶剂化物直接去溶剂化为晶型I而不显示去溶剂化中间体。S-DMFA直接去溶剂化为S-DMF0.5（跳过单溶剂化物），随后去溶剂化为晶型I。S-DMSO1去溶剂化为S-DMSO0.5然后转变为晶型I。对于S-PyrA和S-THF1，在转变为晶型I的途中记录到中间去溶剂化产物（分别为S-Pyr0.5和S-THF0.5）。在干燥条件下，大多数DAP溶剂化物在整个研究期内保持稳定，进一步提示湿度在加速去溶剂化过程中的作用。在潮湿条件下，许多DAP溶剂化物直接去溶剂化为晶型I，但过程比同时施加高温时更慢。S-NMP在整个研究期内保持稳定。在这些储存条件下观察到若干中间体。
3.2 选定DAP溶剂化物湿度驱动转变的原位监测
采用原位变湿度PXRD（VH-PXRD）研究了S-tBuOH、S-2BuOH、S-DMFA、S-DMSO1、S-THF1和S-PyrA。S-tBuOH和S-2BuOH直接去溶剂化为晶型I。S-DMFA在暴露于较高湿度条件下去溶剂化为S-DMF0.5，跳过了在环境条件下形成的S-DMF1。相纯S-DMF0.5在32小时内被记录到，并在11天内保持稳定。S-DMSO1的去溶剂化在实验第6天开始，持续3天，第9天观察到相纯S-DMSO0.5。S-THF1在暴露于升高的相对湿度条件下也去溶剂化为半溶剂化物（S-THF0.5），转变在实验开始8小时内即检测到S-THF0.5的痕迹，48小时内观察到相纯S-THF0.5。S-PyrA在暴露于升高湿度时表现出显著高于其他DAP溶剂化物的稳定性，溶剂化物保持稳定一周，即使实验总计12天后也未完全转变为S-Pyr0.5中间体，同时还记录到晶型I的最初痕迹，使其成为三相混合物中的第三组分。
3.3 DAP去溶剂化路径的温度依赖性监测
基于受控去溶剂化研究和观察到的湿度驱动转变，DAP溶剂化物被分为两组：第一组为形成中间体的溶剂化物（DMF、DMSO、THF和Pyr溶剂化物去溶剂化为较低化学计量比溶剂化物），第二组为直接去溶剂化的溶剂化物（S-MeOH、S-iPrOHI、S-iPrOHII、S-2BuOH、S-tBuOH、S-tAmOH、S-DEE、S-MeEtOH、S-EtEtOH、S-MtBE、S-NMP、S-DMC、S-DXI、S-DXII和S-EB）。两组溶剂化物均通过热台显微镜以及DSC/TGA进行分析。除S-iPrOHII外（仅获得少量单晶），大多数DSC/TGA测量温度范围选择在DAP升华温度（190 °C）以下。
3.3.1 形成中间体的DAP溶剂化物
通过TGA鉴定了形成中间体的溶剂化物及其低化学计量比溶剂化物的化学计量比。以下单溶剂化物被鉴定：S-DMF1、S-DMSO1和S-THF1。相应的半溶剂化物包括：S-DMF0.5、S-DMSO0.5和S-THF0.5。此外，S-PyrA的中间去溶剂化产物被命名为S-Pyr0.5。中间体形成溶剂化物的DSC吸热事件对应于去溶剂化过程，经热台显微镜确认。在所有情况下观察到溶剂损失而无同时熔化。最终，所有形成中间体的溶剂化物在加热时去溶剂化为DAP晶型I。S-DMF1的总质量损失为15.5%，与1：1化学计量比一致。TGA显示两个连续的去溶剂化步骤，DSC显示两个相应的吸热事件。第一步质量损失9.46%对应约0.6 mol DMF/1 mol DAP，第二步6.0%对应约0.4 mol DMF/1 mol DAP。相纯S-DMF0.5记录的8.1%质量损失对应约0.5 mol DMF/1 mol DAP，确认了半溶剂化物的存在。VT-PXRD确认S-DMF0.5作为不同于S-DMF1的独立相在加热时也形成。VT-FTIR实验进一步确认加热单溶剂化物时S-DMF0.5的形成（75 °C）。加热S-DMSO1时观察到总质量损失16.3%，与1：1化学计量比一致。S-DMSO1也表现出两步去溶剂化过程，两个步骤的8.3%和8.1%质量损失分别对应约0.5 mol DMSO/1 mol DAP。在VT-PXRD实验中，S-DMSO1首先去溶剂化为S-DMSO0.5（从75 °C开始），相纯半溶剂化物在115至185 °C之间观察到。S-THF1的TGA分析显示一步质量损失约1 mol THF/1 mol DAP，确认了1：1化学计量比。S-PyrA的TGA分析显示一步质量损失0.8 ± 0.1 mol Pyr/1 mol DAP。S-PyrA也被发现直接去溶剂化为晶型I，VT-PXRD从130 °C开始，VT-FTIR从125 °C开始。从170 °C起观察到相纯晶型I。在温度作为唯一去溶剂化驱动力的实验中，S-PyrA未检测到中间相。DMF和DMSO单溶剂化物向半溶剂化物的转变也被观察到可由热应力单独驱动，而不仅仅是升高的湿度和温度条件。较高的相对湿度条件似乎是触发THF和Pyr高溶剂化物转变为低化学计量比去溶剂化物的必要条件，这些在仅使用温度作为去溶剂化因素时未被观察到。
3.3.2 直接去溶剂化的DAP溶剂化物
此前工作已鉴定S-iPrOHI、S-2BuOH和S-tAmOH为单溶剂化物，S-DXI为1：0.75化学计量比溶剂化物。本工作报告了另外九种直接去溶剂化溶剂化物的热分析。S-tBuOH、S-DEE、S-MtBE、S-NMP和S-DMC被鉴定为单溶剂化物。第二种DX溶剂化物（S-DXII）也表现出1：0.75化学计量比，因此S-DX是一种多晶型溶剂化物，具有两种形式：S-DXI和S-DXII。S-MeEtOH和S-EtEtOH被发现在150 °C以下以单步质量损失失去约0.5 mol溶剂/1 mol DAP。S-EB也被鉴定为溶剂化物，记录的5.7%质量损失对应0.23 mol EB/1 mol DAP。S-EB被证明高度不稳定，从母液中取出后即快速去溶剂化。与TGA热谱同时记录的DSC信号对应于各情况下的去溶剂化过程，与HSM研究一致。未观察到包晶熔化（peritectic melting）的证据，因为晶体在去溶剂化过程中保持其外形（假象转变），随后是DAP晶型I的升华和熔化。
3.4 分子和结构对溶剂化物稳定性的影响
无论溶剂化物组别如何，所有DAP溶剂化物均从溶液中结晶为细无色针状晶体。整体而言，DAP溶剂化物在干燥条件下（25 °C，0% RH）表现出最高稳定性。环境条件较不利，但仍允许比潮湿或加速储存条件更慢的去溶剂化。在潮湿条件下，去溶剂化发生更快，而加速储存条件下升高的温度和湿度组合代表最苛刻的环境，导致最快的溶剂损失。这可能由晶体表面水分吸附引起局部表面软化，导致分子迁移率增加，最终增强溶剂扩散和加速去溶剂化来解释。此外，在某些情况下，加速储存条件使得能够观察到其他方式难以获得的去溶剂化中间体（S-THF1 → S-THF0.5和S-PyrA → S-Pyr0.5）。在四种形成中间体的溶剂化物中，S-PyrA在所有条件下被发现在最稳定，仅在暴露于40 °C、75% RH时显示去溶剂化迹象。四种去溶剂中间体（S-DMF0.5、S-DMSO0.5、S-THF0.5和S-Pyr0.5）记录的实验PXRD图谱表现出显著相似性，提示这些DAP固态形式的结构相似性，并解释了其相似的稳定性。实验粉末图谱成功地在同一单斜空间群中指标化，所有四种中间体显示相似的晶胞参数，进一步支持其同构性以及吡啶半溶剂化物（S-Pyr0.5）的存在。15种直接去溶剂化溶剂化物在暴露于各种条件时表现出稳定性差异，尽管所有最终均转变为DAP晶型I。在所有归入直接去溶剂化溶剂化物组的溶剂化物中，S-NMP是最稳定的：在环境、干燥和潮湿条件下未观察到变化，在加速储存条件下稳定1周。这可归因于NMP的性质，它是强氢键受体且具有低蒸气压。在醇类溶剂化物中，S-MeOH表现出最低稳定性，从母液中取出后立即去溶剂化，其次是S-tAmOH。其他三种醇类溶剂化物（S-iPrOHI、S-2BuOH和S-tBuOH）显著更稳定，在室温下60天内保持不变。脂肪族醚类溶剂化物（S-DEE、S-MeEtOH、S-EtEtOH和S-MtBE）未被发现位于最稳定的DAP溶剂化物之列。S-DEE被证明非常不稳定。对于DX，鉴定出两种溶剂化物：S-DXI可通过浆液法可靠重现和放大，而S-DXII仅能通过反溶剂结晶获得。通过竞争性浆液实验确认S-DXI是稳定的DX溶剂化物。S-EB经常与DAP晶型I混合获得，表明该相的低稳定性。与所有其他形成DAP溶剂化物的溶剂不同，乙苯没有氢键受体或供体基团，提示该溶剂化物的低稳定性。
3.5 DAP溶剂化物形成潜力的计算评估
实验筛选鉴定DAP为高产的溶剂化物形成者，42种受试溶剂中有17种产生溶剂化物。此外，DAP不仅以众多不同溶剂形成溶剂化物而著称，还以同一溶剂形成不同溶剂化物（即不同化学计量比，如三种DMF溶剂化物：S-DMFA、S-DMF1和S-DMF0.5）和溶剂化物多晶型（两种DX溶剂化物多晶型和两种iPrOH溶剂化物多晶型）而著称。对已发表DAP晶体结构的分析揭示溶剂分子在DAP分子的一维柱状排列中充当连接体。因此，采用MCHBP工具基于氢键倾向性估计溶剂化物形成的可能性。计算在有和没有考虑分子内氢键相互作用的情况下进行。结果显示分子内相互作用最强，且在实验结构中也存在。当仅考虑分子间相互作用时，DAP的羧基部分被鉴定为与溶剂优先相互作用的位点，这与实验结构一致。分析确定DMSO、DMF、NMP、Pyr、DMAA、DX和THF为最可能的溶剂化物形成者。实验结果与预测密切匹配，除DMAA外所有溶剂均形成溶剂化物，除NMP外所有情况下均鉴定出多种溶剂化物形式。仅使用这七种溶剂将产生12种溶剂化物，相当于所有实验观察到的溶剂化物的50%。此外，被鉴定为最稳定的溶剂化物（S-PyrA和S-NMP）属于这一范围，表明氢键对DAP溶剂化物稳定性确实至关重要。下一组实验观察到的溶剂化物的MCHBP评分范围为0.03至?0.09，对应于"既不-也不"或已不太可能的区域，包括醇类、醚类和碳酸二甲酯。从虚拟筛选中无法为该组得出趋势，表明晶体堆积可能性和醇类中的支化显著影响DAP溶剂化物的形成。评分最低的溶剂为碳氯化合物、脂肪烃和芳香烃——无法通过经典氢键与DAP相互作用的分子。值得注意的是，EB与DAP形成溶剂化物，尽管在母液外仅非常短暂存在。EB溶剂化物的出现表明DAP作为高产溶剂化物形成者并不限于氢键作为决定性相互作用。MCHBP工具虽然能有效识别强溶剂化物形成者，但在中低评分区域不能可靠区分形成和不形成溶剂化物的溶剂，在该区域溶剂大小、支化和堆积效应可能比氢键更占主导。氢键倾向性单独并非DAP溶剂化物形成的唯一预测因素。
讨论部分总结：本研究全面考察了DAP的固态形式图谱，显著扩展了对其溶剂化物形成倾向的当前认识。在此前和本工作中共鉴定出九种新型溶剂化物（S-tAmOH、S-DMFA、S-DMSO0.5、S-THF0.5、S-DXII、S-EtEtOH、S-PyrA、S-Pyr0.5和S-iPrOHII），并首次详细报道了24种溶剂化物的去溶剂化路径。所有24种DAP溶剂化物均经过全面表征，使得能够可靠地将此前报道的专利形式重新归类为真正的多晶型或溶剂化物。在受控的生产和储存相关湿度和温度条件下进行的稳定性研究揭示了四种去溶剂化中间体。这些发现不仅阐明了潜在的转变路径并识别了用于靶向结晶的（不）合适溶剂，还精确指出了去溶剂化是直接进行至晶型I还是经由中间相。晶型I被指定为此前工作中热力学稳定的无水物，在无溶剂化物形成的溶剂筛选实验中一致获得。此外，所有溶剂化物最终均被观察为去溶剂化为晶型I。因此，基于溶液以及基于固态的筛选技术均导向晶型I，揭示了该固态形式的高结晶倾向。多组分氢键倾向性方法的应用在识别能够形成非常稳定和多种溶剂化物的溶剂分子方面展示了合理的预测能力。然而，该方法对于中低稳定性溶剂化物（较低排名）被证明不足，无法可靠区分形成和不形成溶剂化物的分子。这一局限性表明氢键倾向性虽然对某些DAP溶剂化物重要，但并不构成该API溶剂化物形成的普遍规律。溶剂特征、分子构象和分子灵活性、堆积效率以及其他可能的相互作用如芳香相互作用或紧密接触可能对溶剂化过程贡献更显著。未来的研究因此可以探索整合不同预测方法的更多混合方法，建立在现有工作基础上，包括将MCHBP与COSMO-RS等方法结合或应用不同的机器学习方法。
研究结论翻译：本研究建立了对DAP固态形式图谱的深入理解，为其合理控制提供了基础，对结晶设计、工艺开发和固态形式选择具有直接意义。
