小麦木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶TaXTH16通过ABA介导通路增强小麦抗旱性与穗发芽抗性

《Journal of Advanced Research》：The xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase TaXTH16 enhances wheat drought tolerance and pre-harvest sprouting resistance via ABA-mediated pathways

　　

木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase，XTH）TaXTH16通过脱落酸（abscisic acid，ABA）介导的通路增强小麦（Triticum aestivum L.）抗旱性与穗发芽抗性。TaXTH16编码一种具有木葡聚糖内转糖苷酶（xyloglucan endotransglucosylase，XET）活性并定位于细胞壁和质膜的酶。TaXTH16通过促进木葡聚糖和纤维素积累以及增强ABA生物合成与信号转导，作为抗旱性的正调控因子发挥作用，后者介导了气孔关闭的加速和活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除能力的增强。TaXTH16是ABA响应元件结合因子TaABF2的直接转录靶标；TaABF2-TaXTH16模块将ABA信号转导与干旱诱导的细胞壁重塑联系起来。TaXTH16的一个优良单倍型TaXTH16-2B-HapII表现出更高的启动子活性，赋予更高的抗旱指数，并已在现代品种中得到富集。TaXTH16还可能通过ABA介导的通路增强穗发芽（pre-harvest sprouting，PHS）抗性，使其成为同时改良小麦抗旱性和穗发芽抗性的宝贵遗传靶点。

论文解读：TaXTH16通过ABA介导通路协同调控小麦抗旱性与穗发芽抗性的分子机制

一、研究背景与科学问题

干旱是全球农业生产面临的关键限制因素，气候变化和不可预测的降雨模式进一步加剧了干旱对作物产量的不利影响。小麦作为全球超过20%热量摄入的基础粮食来源，其种植区域中相当大比例处于干旱高发地带，导致严重产量损失。在水资源日益短缺和粮食需求持续增长的背景下，阐明抗旱性的分子机制以培育耐逆品种已成为全球小麦高效生产的迫切需求。

脱落酸（ABA）是调控植物多种生理过程的关键植物激素，涵盖叶片衰老、种子休眠和萌发等发育事件以及对多种环境胁迫的适应性响应。在干旱条件下，ABA作为核心信号介导因子，通过促进气孔关闭以减少蒸腾失水、调控根系构型以增强水分获取、启动保护性代谢过程等关键生理适应机制，使植物得以在水分亏缺条件下存活。核心ABA信号通路已被广泛表征：干旱胁迫快速诱导ABA合成，ABA被RCAR/PYR1/PYL家族胞内受体感知，受体与ABA结合后形成复合物抑制蛋白磷酸酶2C（PP2Cs）的活性，解除对SNF1相关蛋白激酶2（SnRK2）家族成员的抑制，激活的SnRK2激酶磷酸化并激活下游转录因子，其中最为突出的是ABRE结合因子/ABRE结合蛋白（ABFs/AREBs）。尽管已有大量研究阐明了ABA信号通路各组分在植物抗旱中的调控作用，但连接ABA信号与干旱诱导的细胞壁重塑之间的ABFs直接靶基因在很大程度上仍未得到探索。

木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶（XTHs）是一类参与细胞壁重塑的关键细胞壁修饰酶，能够通过连接木葡聚糖分子的还原端和非还原端来切割和/或重新连接木葡聚糖分子，从而生成嵌合的低聚或聚合木葡聚糖结构。XTHs在逆境条件下对植物生长维持和胁迫响应发挥重要作用。多种非生物胁迫（包括干旱和脱水）下的转录组分析频繁报道XTH家族基因的显著上调表达。已有研究表明DkXTH1和CaXTH3通过调节细胞形态发生在转基因拟南芥和番茄中增强抗旱性和耐盐性，BnXTH1通过调控液泡区室化和增强细胞壁镉结合能力提高苎麻镉耐受性，XTH19突变体在冷处理和零下温度处理后表现出较野生型拟南芥降低的冻融耐受性。然而，XTHs在干旱胁迫下是否以及如何受到ABA信号的转录调控，特别是在小麦中，以及这种调控是否与ROS稳态相协调，仍不清楚。

二、研究内容与主要结论

本研究揭示了小麦XTH家族基因TaXTH16作为抗旱性和穗发芽抗性正调控因子的功能与分子机制。研究人员发现TaXTH16在PEG6000模拟干旱条件下显著上调表达，编码具有木葡聚糖内转糖苷酶（XET）活性的酶，定位于细胞壁和质膜。过表达TaXTH16增强小麦抗旱性，而CRISPR/Cas9敲除突变体则降低抗旱性。机制研究表明TaXTH16通过促进木葡聚糖和纤维素积累实现细胞壁重塑，同时增强ABA生物合成与信号转导，后者介导了气孔关闭的加速和ROS清除能力的增强。研究人员进一步鉴定TaABF2为TaXTH16的直接转录激活因子，揭示TaABF2-TaXTH16模块在ABA信号与细胞壁重塑之间的桥梁作用。此外，研究发现TaXTH16-2B存在两种自然单倍型，其中TaXTH16-2B-HapII具有更高的启动子活性、赋予更高的抗旱指数，并已在现代品种中得到富集。该研究还发现TaXTH16通过ABA介导通路增强穗发芽抗性，为同时改良小麦抗旱性和穗发芽抗性提供了宝贵的遗传资源和分子育种靶点。该论文发表在《Journal of Advanced Research》。

三、主要技术方法

研究人员使用了多种关键技术方法：利用PEG6000模拟干旱和ABA处理分析基因表达模式；通过基因枪法转化小麦未成熟胚获得过表达（OE）转基因系，利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得敲除（KO）突变体；采用RT-qPCR进行基因表达分析；利用烟草瞬时表达系统进行亚细胞定位；通过RNA-seq转录组测序（基于Illumina NovaSeq 6000平台）鉴定差异表达基因并进行GO富集分析；采用酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告基因、染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR和电泳迁移率变动分析（EMSA）验证转录因子与启动子的结合；利用HPLC-MS/MS测定植物激素含量；通过NBT和DAB染色及商品化试剂盒测定ROS含量；进行苗期抗旱性鉴定、田间农艺性状评价和穗发芽抗性检测；利用1035份小麦种质资源（中国453份，国外582份）进行单倍型地理分布分析。

四、研究结果

TaXTH16受脱水和ABA诱导，编码小麦中具有功能活性的XET

TaXTH16受PEG6000模拟干旱显著诱导表达，在ABA处理后1小时表达下降但6小时后上升。TaXTH16的三个同源基因在干旱胁迫24小时表达达到峰值，复水后下降。TaXTH16在根和成熟叶中表达较高，在花后35天籽粒中中等表达，在茎、幼叶和早期发育籽粒中表达较低。三个同源基因均包含三个外显子和两个内含子，编码蛋白具有高度序列相似性（>96%），均携带Glyco_hydro_16和XET_C结构域以及高度保守的催化序列DEIDFEFLG。酶活性测定证实TaXTH16具有XET活性，能够催化切割的木葡聚糖分子转移至另一木葡聚糖或寡糖分子。亚细胞定位分析表明TaXTH16与质膜和细胞壁均有关联。

TaXTH16正调控小麦抗旱性

研究人员开发了分别过表达TaXTH16-2A-RFP、TaXTH16-2B-YFP和TaXTH16-2D-GFP的转基因小麦系，以及通过CRISPR/Cas9同时敲除三个同源基因的KO突变体。干旱处理后，OE系表现出较WT更轻的萎蔫和显著更高的复水存活率，离体叶片失水率更低；KO系则表现出更严重的萎蔫、更低的存活率和更高的失水率。在干旱条件下，OE系木葡聚糖和纤维素含量显著高于WT，KO系则相反，为TaXTH16介导的干旱胁迫下细胞壁重塑提供了直接证据。

TaXTH16参与ABA介导的气孔关闭调控

干旱处理后，OE系气孔开度显著小于WT，KO系显著大于WT。OE系在干旱处理各时间点完全开放气孔比例较低，部分开放或完全关闭气孔比例较高，表明TaXTH16过表达加速气孔关闭；KO系则相反。外源ABA处理的效果与干旱处理类似。干旱处理后OE系ABA含量显著高于WT，KO系显著低于WT。OE系ABA生物合成基因TaNCED1和TaNCED3表达水平较高，KO系较低。在ABA处理条件下，OE系种子萌发率、苗高和根长均低于WT，KO系则高于WT。ABA响应基因TaOST1和TaNAC2在OE系中显著上调，在KO系中显著下调。

TaXTH16参与ABA介导的ROS清除

转录组分析显示，干旱条件下OE系差异表达基因显著富集于胁迫响应、氧化胁迫响应、水杨酸响应、渗透胁迫响应、非生物刺激响应、水分剥夺响应、ABA响应、ROS响应和过氧化氢响应等GO条目。干旱处理后，OE系NBT和DAB染色较弱，O₂^•-和H₂O₂含量较低，KO系则相反。OE系抗氧化酶基因TaSOD1、TaSOD3、TaCAT1和TaGPX3表达水平显著高于WT，KO系显著低于WT。ABA处理后OE系积累较少的O₂^•-和H₂O₂，KO系积累较多，表明ABA积极参与TaXTH16增强的ROS清除过程。

TaXTH16过表达提高干旱条件下的水分利用效率和籽粒产量

在雨养（干旱）田间条件下，OE系光合速率和水分利用效率（WUE）显著高于WT，气孔导度和蒸腾速率较低；KO系则相反。在雨养环境中OE系单株产量显著高于WT，主要与单株穗数增加相关；KO系产量显著降低，主要由于千粒重下降。在正常灌溉环境中OE和KO系产量与WT无显著差异。

TaXTH16过表达提高小麦穗发芽抗性

2023年6月黄淮海平原持续降雨导致小麦严重穗发芽（PHS），该年度OE系单株产量和千粒重均高于WT，KO系则相反。PHS检测结果显示OE系可见芽鞘籽粒（VSKs）百分比和穗上萌发种子百分比均低于WT，KO系则高于WT。ABA处理后OE系对ABA响应更明显，VSKs和穗上萌发降低幅度更大；KO系对ABA响应较弱。

TaXTH16是转录因子TaABF2的直接靶基因

TaXTH16启动子区域含有多个ABRE顺式作用元件。酵母单杂交（Y1H）实验表明TaABF2而非TaABF1或TaABF3能够激活TaXTH16启动子。双荧光素酶报告实验证实TaABF2能够显著提高TaXTH16启动子驱动的LUC/REN比值。ChIP-qPCR实验显示TaABF2在TaXTH16启动子含ABRE元件的亚区域显著富集。EMSA实验证实纯化的TaABF2-His蛋白能够与含单个或两个保守ABRE（TACGTG）基序的探针结合，而ABRE基序突变为AAAAAA的突变探针则不能结合。

TaXTH16-2B单倍型变异与小麦抗旱性相关

序列分析发现TaXTH16-2A无核苷酸变异，TaXTH16-2D启动子区域仅有一个SNP，而TaXTH16-2B存在两种单倍型（TaXTH16-2B-HapI和TaXTH16-2B-HapII），其启动子区域存在广泛差异。在91份中国小麦品种中，TaXTH16-2B-HapII与更高的抗旱指数（DRI）显著关联。携带TaXTH16-2B-HapII的品种TaXTH16-2B转录水平普遍高于携带HapI的品种，且HapII启动子活性显著高于HapI。通过启动子分段和点突变分析，鉴定出ProE1片段中的ABRE1和ABRE2是ABA响应性的关键元件。在全球1035份小麦种质中，中国材料中HapII比例为37.09%，国外材料中为21.65%；现代品种中HapII频率（中国44.84%，国外28.74%）均高于地方品种（中国20.28%，国外12.10%），表明HapII在育种过程中被优先保留。中国河北省材料中HapII频率最高（63.46%），该省为半干旱小麦种植区。

五、讨论与结论

本研究揭示了TaXTH16通过ABA介导通路增强小麦抗旱性和穗发芽抗性的分子机制。在干旱胁迫下，ABA生物合成和信号转导增强激活转录因子TaABF2，TaABF2直接结合TaXTH16启动子中的ABRE元件并上调其表达。TaXTH16促进木葡聚糖和纤维素积累并增强ABA生物合成和信号转导。增强的ABA生物合成和信号转导导致干旱胁迫下气孔关闭加速和ROS清除能力增强。木葡聚糖和纤维素积累增加所赋予的细胞壁重塑，加上增强的气孔关闭和ROS清除，共同贡献于抗旱性。此外，TaXTH16通过ABA介导通路增强穗发芽抗性，但连接ABA与TaXTH16表达的上游转录因子仍有待鉴定。TaXTH16过表达和TaXTH16-2B-HapII的标记辅助选择（MAS）代表了通过分子育种改良小麦抗旱性和穗发芽抗性的有前景的途径。