Cs4-SeNPs经肠道菌群-骨轴促进生长期小鼠骨发育的作用及机制研究

《Journal of Advanced Research》：The stimulative effect of Cordyceps sinensis functionalized selenium nanoparticles on bone development in growing mice: involvement of the gut microbiota-bone axis

　　

Cs₄-SeNPs提高了生长期小鼠的峰值骨量和骨微结构。Cs₄-SeNPs通过调节TNF-R1/TAB2/NF-κB轴和增强抗氧化活性优化骨重塑。Adlercreutzia和Parvibacter是Cs₄-SeNPs增加生长期小鼠骨量的关键功能菌株。微生物代谢物犬尿喹啉酸和trehalose（海藻糖）是Cs₄-SeNPs调节骨中靶蛋白的关键介质。

骨质疏松症（Osteoporosis, OP）是以骨密度和骨质量下降、骨微结构退化和骨脆性增加为特征的全身性骨病，主要影响老年人和绝经后女性。峰值骨量（Peak Bone Mass, PBM）是骨骼成熟期达到的最大骨组织量，被广泛认为是OP最重要的决定因素。流行病学证据表明，PBM增加10%可使OP发病延迟13年；而儿童期骨量减少6.4%与成年后骨折风险增加1倍相关。因此，在儿童和青少年时期最大化PBM和骨强度是降低未来OP风险的关键策略。肠道菌群通过产生可扩散至体循环的微生物代谢物，建立“肠道菌群-骨轴”，在调节骨代谢中发挥核心作用。硒（Selenium, Se）是必需微量元素，缺硒与OP和Kashin-Beck骨关节病等低骨量疾病相关。研究人员前期利用蛹虫草多糖蛋白复合物（Cordyceps sinensis polysaccharide-protein complex, Cs₄ PSP）成功制备了功能化硒纳米颗粒（Cs₄-SeNPs），并证实其可通过骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein, BMP）信号通路促进成骨，对卵巢切除（Ovariectomy, OVX）诱导的OP具有显著骨保护作用。然而，Cs₄-SeNPs是否通过肠道菌群-骨轴促进生长期骨发育尚未阐明。基于此，研究人员假设Cs₄-SeNPs可通过调节肠道菌群组成及其代谢物来增强PBM，并利用宏基因组学、代谢组学和蛋白质组学等多组学整合策略，系统揭示其作用机制。

研究人员使用21日龄雄性C57BL/6小鼠（购自珠海百斯特生物科技有限公司）进行动物实验。实验1中，小鼠随机分为对照组和Cs₄-SeNPs组，每日灌胃生理盐水（10 mL/kg）或Cs₄-SeNPs（20 μg/kg），持续8周。实验2中，40只小鼠随机分为4组，分别给予生理盐水、Cs₄-SeNPs、抗生素鸡尾酒（万古霉素、新霉素、甲硝唑、氨苄青霉素）或抗生素+Cs₄-SeNPs，以耗竭肠道菌群。通过Micro-CT扫描、骨组织学染色、DIA定量蛋白质组学、粪便UHPLC-QTOF/MS非靶向代谢组学、宏基因组测序及血清靶向代谢组学进行分析；细胞实验采用MC3T3-E1成骨前体细胞和RAW264.7破骨前体细胞，结合CCK-8、ALP染色、茜素红S染色、TRAP染色、免疫荧光、Western blot和RT-PCR等方法验证关键代谢物的功能。

结果部分，研究人员首先成功制备了Cs₄-SeNPs并对其进行表征。Cs₄-SeNPs为均匀单分散球形颗粒，平均核心尺寸约30–40 nm，水合粒径为80.1±1.04 nm，Zeta电位为?15.9±0.25 mV，在水溶液中具有8周以上的高稳定性。FT-IR和Raman光谱证实Cs₄ PSP通过活性官能团稳定SeNPs，并确认其为无定形元素硒。功能验证表明，Cs₄-SeNPs显著提高了生长期小鼠股骨骨密度（Bone Mineral Density, BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、组织矿化密度（Tissue Mineral Density, TMD），同时降低骨小梁分离度（Tb.Sp），并增加了皮质骨TMD；尿中脱氧吡啶啉（Deoxypyridinoline, DPD）水平显著降低，提示骨吸收减少。同时，骨组织中成骨标志物Alp、Col1α1、Ocn、Sp7的mRNA表达以及COL1α1、RUNX2、OPN蛋白水平升高，β-Catenin蛋白增加、p-GSK3β（Ser9）减少，表明Wnt/β-Catenin通路被激活。

通过DIA定量蛋白质组学分析，研究人员在Cs₄-SeNPs组与对照组之间鉴定出183个差异表达蛋白（Differentially Expressed Proteins, DEPs），其中上调50个、下调133个。GO富集显示这些DEPs与信号转导、膜相关蛋白相关；KEGG富集显示下调DEPs富集于TNF信号通路、IL-17信号通路和破骨细胞分化通路。蛋白质互作网络分析提示TNF-R1为关键种子节点。进一步验证表明，Cs₄-SeNPs显著下调骨组织中TAB2、p-P65、TNF-R1、CTSK和TRAP蛋白水平，上调SERPINA3K水平，同时GPX1和SOD表达增强，说明Cs₄-SeNPs通过抑制TNF-R1/TAB2/NF-κB轴和增强抗氧化活性来优化骨重塑。

粪便代谢组学分析显示，Cs₄-SeNPs改变了71种代谢物（29种上调、42种下调），其中犬尿喹啉酸（kynurenic acid）和海藻糖（trehalose）与骨形成相关骨参数呈显著正相关，并与关键DEPs（NFRKB、TAB2、TNFRSF1A、SERPINA3K）相关，且Cs₄-SeNPs不影响短链脂肪酸水平。宏基因组测序显示，Cs₄-SeNPs虽不改变肠道菌群α多样性，但显著改变了β多样性，在属水平上增加了Adlercreutzia、Enterorhabdus和Parvibacter的丰度，降低了Desulfovibrio和Bifidobacterium的丰度；在种水平上，Adlercreutzia caecimuris、Parvibacter caecicola等显著富集。相关分析表明，Adlercreutzia和Parvibacter与骨形成参数呈正相关，并与犬尿喹啉酸和海藻糖水平正相关。

体外实验进一步证实，犬尿喹啉酸和海藻糖均能剂量依赖性地抑制RANKL诱导的RAW264.7细胞破骨分化，减少TRAP阳性多核细胞数，下调Trap、Ctsk、Atp6v0d2、Car2、Calcr、Dcstamp、c-Fos和Nfatc1等破骨相关基因表达，并抑制TNF-R1/TAB2/NF-κB通路，上调GPX1和SERPINA3K。值得注意的是，犬尿喹啉酸还能促进MC3T3-E1细胞增殖、ALP活性和矿化结节形成，上调Alp、Runx2、Sp7、Ocn表达及COL1α1、OPN、OPG蛋白水平，并激活GSK3β/β-Catenin通路；而海藻糖对成骨分化无促进作用。最后，抗生素耗竭肠道菌群实验显示，Cs₄-SeNPs对骨参数和成骨标志物的改善作用被完全消除，血清中犬尿喹啉酸和海藻糖的升高也被逆转，证明Cs₄-SeNPs的骨发育促进作用依赖肠道菌群。

讨论部分指出，Cs₄-SeNPs同时具有促进骨形成和抑制骨吸收的双重作用，不同于传统单靶点药物。其机制涉及肠道菌群（特别是Adlercreutzia和Parvibacter）通过增加犬尿喹啉酸和海藻糖的产生，进而抑制TNF-R1/TAB2/NF-κB炎症通路并激活抗氧化酶（GPX1、SOD等），最终优化骨重塑。安全性方面，Cs₄-SeNPs的急性毒性远低于无机硒和有机硒，亚慢性毒性实验未观察到明显组织损伤，其使用剂量低于NIH推荐的可耐受上限，具有良好转化前景。

研究结论部分可翻译为：总之，本研究首次证明Cs₄-SeNPs通过改善成骨细胞/破骨细胞平衡有效提高峰值骨量。这种骨促进效应以肠道菌群依赖性方式介导，其特点是肠道菌群Adlercreutzia和Parvibacter富集，微生物代谢物犬尿喹啉酸和海藻糖产生增加，TNF-R1/TAB2/NF-κB炎症通路受抑制以及抗氧化酶被激活。综上，该研究强调了Cs₄-SeNPs作为青春期优化峰值骨量获得的辅助策略具有广阔前景。未来研究需进一步明确Adlercreutzia和Parvibacter在产生犬尿喹啉酸和海藻糖及调控TNF-R1/TAB2/NF-κB轴中的作用，并评估其作为下一代益生菌用于治疗和预防代谢性骨病的潜力。该论文发表于《Journal of Advanced Research》。