Uqcrc2 K109乳酸化修饰通过靶向线粒体呼吸链促进脓毒症诱导心肌病

《Journal of Advanced Research》：Uqcrc2 lactylation promotes sepsis-induced cardiomyopathy by targeting the mitochondrial respiratory chain

　　

摘要专业翻译 脓毒症是一种以感染引起的失调反应导致器官功能障碍为特征、危及生命的综合征。脓毒症诱导心肌病（sepsis-induced cardiomyopathy，SIC）是脓毒症的主要表现之一，发生于13.8%–50.3%的脓毒症患者中，并使短期死亡率几乎翻倍。SIC的机制包括过度炎症反应、线粒体损伤和氧化应激等，其发病机制复杂且尚未完全阐明，目前缺乏特异性治疗手段。蛋白质翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）是调节蛋白质功能的重要机制，在疾病治疗中展现出作为重要药物靶点的巨大潜力。乳酸广泛参与脓毒症的发病过程，血清乳酸水平升高与脓毒症器官功能障碍相关，因此乳酸介导的乳酸化修饰（lactylation）预期在脓毒症病理过程中发挥重要作用。本研究通过蛋白质组学分析鉴定了与SIC相关的乳酸化修饰蛋白，并通过生物信息学分析和分子实验进一步筛选了参与SIC的潜在乳酸化修饰蛋白及其修饰位点，阐明了其在SIC中的作用机制。研究发现，脓毒症心肌组织呈现独特的乳酸化修饰图谱，包含431个上调位点和8个下调位点；Uqcrc2蛋白K109位点的乳酸化修饰在SIC发病机制中发挥因果作用；机制上，K109乳酸化修饰损害线粒体呼吸功能并启动心肌细胞凋亡级联反应；研究进一步鉴定KAT6A为介导这一特异性Uqcrc2修饰的乳酸转移酶。

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一、研究背景与科学问题

脓毒症是由感染引起宿主反应失调而导致的危及生命的器官功能障碍综合征，其发病率高、病死率高，是重症医学领域的重大挑战。脓毒症诱导心肌病（sepsis-induced cardiomyopathy，SIC）是脓毒症的重要并发症，发生于13.8%–50.3%的脓毒症患者中，可使短期死亡率几乎翻倍。SIC的发病机制涉及过度炎症反应、线粒体损伤和氧化应激等多个方面，病理过程复杂且尚未完全阐明，目前临床上缺乏针对SIC的特异性治疗手段，管理策略主要集中于控制感染和维持血流动力学稳定。

蛋白质翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）是调控蛋白质功能的重要机制，包括磷酸化、乳酸化、泛素化、甲基化和乙酰化等，在疾病治疗中展现出作为药物靶点的巨大潜力。乳酸广泛参与脓毒症的发病过程，血清乳酸水平升高与脓毒症器官功能障碍密切相关，因此乳酸介导的乳酸化修饰（lactylation）预期在脓毒症病理过程中发挥重要作用。尽管乳酸化修饰为脓毒症研究提供了新方向，但其在脓毒症不同靶器官中的具体作用和调控机制尚不清楚。基于此，研究人员开展了本研究，旨在通过蛋白质组学手段系统鉴定参与SIC的乳酸化修饰蛋白，阐明其作用机制，为SIC的防治提供新的分子靶点。

二、研究技术与方法概述

研究人员建立了盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）小鼠脓毒症模型和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的脓毒症模型，并采用乳酸刺激AC16人心肌细胞建立心肌细胞损伤模型。研究运用定量乳酸化修饰组学（lactylome）分析筛选差异乳酸化修饰位点，结合生物信息学KEGG通路富集分析锁定核心靶蛋白；采用质谱鉴定、多物种序列比对和晶体结构分析验证修饰位点的保守性与结构意义；通过分子对接和分子动力学模拟分析乳酸化修饰对蛋白复合物结合亲和力的影响；运用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）、Western blot、线粒体呼吸链复合物III活性检测、Seahorse XF96细胞线粒体压力测试、活性氧（reactive oxygen species，ROS）检测、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）检测、CCK-8细胞活力检测、超声心动图、HE染色和透射电子显微镜等技术手段，从分子、细胞和动物整体水平系统阐明Uqcrc2 K109乳酸化修饰在SIC中的作用及机制。

三、主要研究结果

Uqcrc2 K109乳酸化修饰在SIC心脏组织中异常升高

研究人员通过CLP手术建立小鼠脓毒症模型，发现模型组血清乳酸水平显著升高，心脏组织中泛赖氨酸乳酸化（Pan-Kla）水平明显高于假手术组，心肌细胞乳酸化水平升高，心功能显著下降。通过乳酸化修饰组学分析，共鉴定出439个差异乳酸化位点，其中431个位点上调和8个位点下调。基于倍数变化筛选前30个差异乳酸化蛋白进行KEGG通路富集分析，发现Uqcrc2 K109位点乳酸化富集于代谢通路、氨基酸生物合成、氧化磷酸化和糖尿病心肌病等多个心肌疾病相关通路。质谱分析确认了Uqcrc2 K109乳酸化位点，多物种序列比对显示该位点在进化上高度保守，晶体结构分析显示K109残基位于Uqcrc1-Uqcrc2蛋白复合物的重要结合界面。在CLP和LPS两种脓毒症模型中，总Uqcrc2蛋白水平无显著差异，但Uqcrc2乳酸化水平均显著升高，表明Uqcrc2乳酸化修饰参与SIC的发病过程。

Uqcrc2 K109乳酸化修饰是心肌细胞线粒体损伤的重要驱动因素

分子对接和分子动力学模拟实验显示，Uqcrc2 K109乳酸化降低了Uqcrc1与Uqcrc2之间的结合亲和力，K109乳酸化后的Uqcrc1-Uqcrc2复合物骨架均方根偏差（root-mean-square deviation，RMSD）高于未乳酸化状态。免疫共沉淀实验证实CLP组小鼠心脏组织中Uqcrc1与Uqcrc2的相互作用显著减弱，线粒体呼吸链复合物III活性显著降低。在AC16细胞中，乳酸剂量依赖性地增加Pan-Kla水平和Uqcrc2乳酸化水平，同时抑制复合物III活性。研究人员构建了Uqcrc2 K109R突变质粒以阻断该位点乳酸化修饰，结果显示K109R突变可抑制Uqcrc2乳酸化、恢复乳酸抑制的复合物III活性、逆转乳酸引起的线粒体呼吸链损伤、抑制ROS产生和线粒体膜电位去极化，并挽救乳酸诱导的心肌细胞线粒体凋亡和细胞死亡。

KAT6A是Uqcrc2乳酸化修饰的关键修饰酶

研究人员通过免疫沉淀结合液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析，从AC16细胞Uqcrc2免疫沉淀物中鉴定出CREBBP、AARS、KAT6A、HDAC1和HDAC2等差异富集蛋白。分子对接预测KAT6A与Uqcrc2存在强相互作用，免疫共沉淀实验证实了二者的结合，结构建模预测乳酸辅酶A（lactyl-CoA）可成功对接进入KAT6A辅因子结合口袋。体外实验表明，KAT6A特异性抑制剂WM-1119处理不影响AC16细胞活力，但显著降低Uqcrc2乳酸化水平，并有效挽救乳酸诱导的心肌细胞活力损伤。体内实验进一步证实，WM-1119可显著降低CLP小鼠心脏组织中Uqcrc2乳酸化水平，改善脓毒症诱导的心功能障碍和病理损伤。

抑制Uqcrc2乳酸化有效缓解SIC

研究人员选用乳酸脱氢酶-A（lactate dehydrogenase-A，LDH-A）抑制剂草酸钠（sodium oxamate）以400 mg/kg剂量处理脓毒症小鼠。结果显示，草酸钠显著降低脓毒症小鼠外周血乳酸水平，降低Uqcrc2乳酸化水平，减轻线粒体损伤和心肌细胞死亡，逆转CLP诱导的心功能障碍，并明显改善小鼠脓毒症评分。

四、讨论与结论

本研究首次通过乳酸化修饰组学分析提供了脓毒症心肌损伤中乳酸化修饰蛋白的全景图谱，证实Uqcrc2 K109乳酸化修饰参与SIC的发病过程，并鉴定KAT6A为一种新型乳酸转移酶催化Uqcrc2乳酸化修饰。既往乳酸化修饰在脓毒症中的研究主要集中于巨噬细胞，关于乳酸化修饰与脓毒症器官损伤关系的研究有限。本研究阐明了Uqcrc2 K109乳酸化修饰在脓毒症心肌损伤中的关键作用，且Uqcrc2在包括人类和小鼠在内的哺乳动物中高度保守，支持该靶点的转化应用价值。Uqcrc2是线粒体电子传递链复合物III的核心亚基，对电子传递和ATP产生至关重要。本研究首次证明Uqcrc2乳酸化修饰通过调控复合物III活性调节线粒体功能，阐明其在脓毒症心肌病中的致病作用。KAT6A此前未见催化蛋白质乳酸化修饰的报道，本研究全面阐明了KAT6A乳酸化Uqcrc2促进SIC发展的机制。

研究结论：本研究证明KAT6A作为新型乳酸转移酶催化Uqcrc2乳酸化修饰，从而损害线粒体呼吸链复合物完整性并驱动心肌细胞损伤，为SIC的发病机制提供了新的见解，Uqcrc2 K109乳酸化修饰可作为调控SIC的核心靶点。