尿液中PAH羧酸类代谢物作为甲基化PAHs暴露生物标志物及其与尿液致突变性的关联研究

《Environmental Science: Processes and Impacts》：Urinary PAH carboxylic acids as exposure biomarkers for methylated PAHs linked to urinary mutagenicityOpen Access

新兴证据提示，甲基化多环芳烃（methyl-PAHs）较其未取代的母体PAHs具有更强的致癌潜力。既往在中国宣威开展的研究报道，暴露于烟煤及高水平环境甲基-PAHs（包括5-甲基?（5-MC））的非吸烟女性肺癌风险升高。研究人员对48名使用四种家庭燃料类型（无烟囱烟煤、有烟囱烟煤、无烟煤和电力）的女性开展了生物监测，评估了包括5种PAH羧酸类代谢物（PAH-CAs）在内的甲基化PAHs内剂量标志物，以及包括5种羟基化PAHs（OH-PAHs）在内的未取代PAHs剂量标志物。尿液OH-PAHs和PAH-CAs从无烟囱烟煤到电炊事呈递减梯度。在比较有烟囱烟煤与无烟煤时，仅PAH-CAs（尤其是菲-2-甲酸（2-PHECA）和二苯并呋喃-4-甲酸（4-DFCA））反映了空气中5-MC和苯并[a]芘（BaP）的差异。空气中5-MC解释了尿液2-PHECA变异的50%（R² = 0.50），而BaP仅解释30%（R² = 0.30）。在18份进行致突变性分析的样本中，尿液2-PHECA与致突变效力强相关（Spearman ρ = 0.74，p < 0.001），而1-羟基芘（1-OHPYR）关联较弱（ρ = 0.49，p = 0.04）。这些发现提示，PAH-CAs（尤其是2-PHECA）可作为内剂量标志物，反映与致突变效力相关的甲基化PAHs生物学相关暴露。

**研究背景与意义**

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。在中国云南省宣威县，20世纪70年代非吸烟女性的肺癌死亡率约为全国平均水平的8倍，流行病学研究一致地将这一异常升高的风险与当地"烟煤"（一种沥青质煤）在传统炉灶中燃烧产生的高浓度室内空气污染物相联系。近年来，越来越多的证据表明，甲基化多环芳烃（methyl-PAHs）相较于未取代的母体PAHs具有更高的致癌潜力。在宣威女性中开展的基于人群的病例对照研究显示，包括5-甲基?（5-MC）在内的甲基化PAHs个人暴露与肺癌风险的关联强于苯并[a]芘（BaP）。一项纳入约42 520名宣威居民的前瞻性队列研究进一步报告了5-MC与肺癌之间强 exposure-response 关系。然而，尽管环境甲基-PAHs与肺癌风险的关联证据不断增加，由于缺乏甲基化PAHs的暴露生物标志物，在人体中通过生物监测确认甲基-PAHs的存在并评估其与癌症风险相关性的关键数据缺口仍然存在。研究人员此前已鉴定多环芳烃羧酸类代谢物（PAH-CAs）为甲基化PAHs的有前景的暴露生物标志物，并开发了可同时定量尿液中PAH-CAs与常规羟基化PAHs（OH-PAHs）的LC-MS/MS方法。PAH-CAs是在家庭燃煤典型的低温、限氧燃烧条件下优先由烷基化PAHs形成的氧化开环代谢物，而OH-PAHs主要反映高温燃烧产生的未取代母体PAHs暴露。既往现场研究显示，PAH-CAs（尤其是菲-2-甲酸（2-PHECA））与富含甲基-PAHs的暴露混合物的相关性优于与总母体PAH负荷的相关性，支持其作为甲基化PAH暴露内剂量生物标志物的应用。本研究旨在测量宣威48名使用四种家庭燃料类型女性尿液中的5种OH-PAHs和5种PAH-CAs，并探讨其与空气PAHs水平及尿液致突变效力的关联，以填补上述数据缺口。

**关键技术方法**

研究人员依托1993年在宣威开展的社区横断面研究（母研究纳入120名45–60岁非吸烟女性），选取48名有足够存档尿液样本的参与者，按家庭燃料类型分为四组：无烟囱烟煤（n = 17）、有烟囱烟煤（n = 9）、无烟煤（n = 12）和电力（n = 10）。室内空气PAH浓度数据来自母研究连续3个24 h采样（流速4 L min^?1），采用气相色谱-质谱联用（GC/MS）定量。尿液OH-PAHs和PAH-CAs经酶水解、液液萃取和固相萃取净化后，采用LC-MS/MS在负电喷雾电离模式下分析；氨基-PAHs在正电喷雾电离模式下分析。尿液致突变性采用沙门氏菌（Ames）平板掺入试验（菌株YG1041，加S9混合物）评估，以致突变效力（每毫升尿液当量的回复突变数，rev. per mL-eq.）表示。统计分析采用Kruskal–Wallis秩和检验和双侧Mann–Whitney U检验进行组间比较，采用Spearman秩相关系数评估暴露与生物标志物及致突变效力之间的关联。

**研究结果**

**燃料类型间尿液PAH代谢物浓度差异**：除三种氨基-PAHs（2-氨基芴（2-AF）、9-氨基菲（9-APHE）和1-氨基芘（1-AP））外，所有代谢物检出率均为100%。尿液OH-PAHs和PAH-CAs在所有燃料类型间呈现从无烟囱烟煤到有烟囱烟煤、无烟煤和电炊事的明显递减梯度。氨基-PAHs中仅1-AP在各燃料组间差异显著（p < 0.05）。与无烟囱烟煤相比，有烟囱烟煤的 airborne PAHs和尿液生物标志物均显著降低，凸显了炉灶通风的保护作用。

**有烟囱烟煤与无烟煤的对比**：空气中5-MC和BaP浓度在有烟囱烟煤组仍显著高于无烟煤组。在尿液生物标志物中，仅2-PHECA和4-DFCA呈现与燃料类型一致的对比模式，而OH-PAHs在两组间差异较弱或不一致。这表明PAH-CAs（尤其是2-PHECA）较OH-PAHs更密切地反映空气中5-MC水平。

**外暴露与尿液PAH生物标志物的关联**：在log₁₀转换的普通最小二乘回归模型中，空气中BaP浓度与所有测定的OH-PAHs呈正相关，其中与1-OHPYR的关联最强（R² = 0.40）。空气中5-MC浓度与2-PHECA（R² = 0.50）、4-DFCA（R² = 0.42）和2-萘甲酸（2-NAPCA；R² = 0.36）强相关。2-PHECA与5-MC的关联（R² = 0.50）强于与BaP的关联（R² = 0.30），而1-OHPYR与BaP（R² = 0.40）和5-MC（R² = 0.43）的关联相当。空气中5-MC解释了尿液2-PHECA变异的50%，而BaP仅解释30%。

**尿液PAH生物标志物与致突变效力的关联**：18份样本中10份显示可测量的致突变反应，平均致突变效力为14.7 ± 16.7 rev. per mL-eq.。与既往研究一致，5-MC对尿液致突变效力的影响大于BaP。2-PHECA与致突变效力呈强正相关（Spearman ρ = 0.74，p < 0.001），强于1-OHPYR（ρ = 0.49，p = 0.04）。

**讨论部分总结**

本研究首次提供了生物监测证据，表明燃煤烟雾暴露增加了甲基化-PAHs的内剂量标志物。尿液致突变效力与尿液2-PHECA水平高度相关（ρ = 0.74），且该关联强于常用PAH暴露生物标志物1-OHPYR，支持甲基化PAHs对燃煤烟雾致癌潜力有重要贡献的假说。尽管1-OHPYR广泛用作一般PAH暴露生物标志物，但其与肺癌风险的关联在流行病学研究中不一致，这可能反映PAH混合物组成的差异而非总PAH负荷。甲基化PAHs在低温、限氧燃烧条件下优先生成，具有增强的致突变性和致癌性。由于5-MC代谢物的正宗标准品无法商业获得，直接生物监测5-MC暴露仍具挑战性；PAH-CAs作为甲基-PAHs的下游代谢物，与5-MC和尿液致突变性的相关性更强。不同燃料类型间尿液PAH代谢物谱的差异凸显了特异性生物标志物在表征燃煤相关暴露中的价值。PAH-CAs较OH-PAHs似乎是更敏感、更具燃料类型特异性的燃煤暴露尿液生物标志物。PAH代谢物不仅可作为总PAH暴露的指标，还可作为反映不同排放谱的源特异性生物标志物。2-PHECA与空气中5-MC强相关，提示其反映了室内烟煤使用典型低温限氧燃烧（类似于生物质燃烧条件）产生的甲基化PAHs暴露。本研究存在若干局限性：样本量较小（48名女性）限制了统计效力和普适性；存档尿液样本缺乏肌酐测量可能引入归一化不确定性，长期储存可能影响生物标志物稳定性；分析聚焦于5-MC因其与其它PAHs高度相关且具有明确的流行病学相关性，未显式建模其他PAHs或共排放污染物的个体共暴露；单时间点尿液测量可能无法完全捕捉长期暴露变异；空气PAHs为3天整合样本，无法评估日特异性暴露窗口或滞后关系；2-PHECA与肺癌风险之间的直接流行病学证据目前尚缺乏；可用于致突变性测试的样本数量有限，无法进行正式的中介分析；研究聚焦宣威室内燃煤可能限制对其他暴露环境的适用性。未来需要更大规模、纵向队列、重复生物标志物测量、综合混合物分析和直接健康结局评估的研究来进一步评价PAH羧酸类作为致癌暴露生物标志物的作用。值得注意的是，甲基化PAHs暴露并不限于家庭燃煤，生物质燃烧（如野火和柴火炉/壁炉）在类似低温限氧条件下也可生成甲基化PAHs，烟草制品是另一潜在重要暴露源。因此，PAH羧酸类作为甲基化PAHs暴露生物标志物的生物监测可能适用于野火烟雾、木材烟雾和烟草烟雾暴露人群。

**研究结论翻译**：这些发现提示，PAH-CAs（尤其是2-PHECA）可作为内剂量标志物，反映与致突变效力相关的甲基化PAHs生物学相关暴露。尿液菲-2-甲酸（2-PHECA）被鉴定为致癌性甲基化多环芳烃（PAHs）暴露的内剂量生物标志物，并与尿液致突变活性强相关，为高暴露人群肺癌风险提供了机制性见解。甲基化PAHs在低温、限氧燃烧条件下优先生成，如家庭燃煤相关条件。由于类似的燃烧条件发生于生物质燃烧（包括野火和住宅木材燃烧）过程中，甲基化PAHs预计在这些暴露环境中也普遍存在。因此，对PAH羧酸类进行生物监测可能为评估受野火烟雾和木材烟雾影响人群中健康相关PAH暴露提供一种生物学相关且具源指示性的方法。