《Journal of Advanced Research》：Identifying phase separation modulators mediated by the SARS-CoV-2 nucleocapsid protein using a structure-based drug discovery approach
编辑推荐：
专业翻译：本研究阐述了靶向SARS-CoV-2核衣壳蛋白（nucleocapsid protein, N蛋白）N端结构域（N-terminal domain, NTD）抑制剂的虚拟筛选（virtual screening, VS）与结构优化过程。研究人员评估了
专业翻译：本研究阐述了靶向SARS-CoV-2核衣壳蛋白（nucleocapsid protein, N蛋白）N端结构域（N-terminal domain, NTD）抑制剂的虚拟筛选（virtual screening, VS）与结构优化过程。研究人员评估了化合物的靶标亲和力与抗病毒活性，并总结了构效关系（structure–activity relationships, SAR）。化合物II8具有强效抗病毒活性，并与N蛋白表现出高亲和力。体内评价表明，化合物II8有望作为局部预防性鼻喷雾剂；然而，鉴于其药代动力学特征，仍需对II8进行进一步结构优化。化合物II8对N-RNA凝聚体形成的破坏作用提示，靶向液-液相分离（liquid–liquid phase separation, LLPS）的有序结构可作为调控相分离的潜在策略。
论文解读文章
研究背景与问题：病毒利用宿主细胞的生理微环境完成生命周期，常需形成特化区室或囊泡，这类细胞内凝聚体（包括无膜细胞器）主要由液-液相分离（LLPS）驱动。在病毒感染细胞中，这些动态凝聚体促进病毒基因组复制、转录、包装、免疫逃逸等多个环节。SARS-CoV-2的核衣壳蛋白（N蛋白）由419个氨基酸组成，包含N端结构域（NTD）和C端结构域（CTD）以及三个 intrinsically disordered regions（IDRs）。N蛋白的NTD可通过LLPS与G3BP1相互作用形成应激颗粒样凝聚体，并竞争性干扰cGAS-G3BP1相互作用，从而逃逸宿主先天免疫。靶向N蛋白的小分子抑制剂有望通过破坏N蛋白-RNA凝聚体形成来抑制病毒复制。然而，目前关于基于结构的N介导LLPS调控剂的报道极少，且现有化学库的药效团多样性有限，阻碍了新骨架抗病毒药物的发现。为此，研究人员采用基于结构的虚拟筛选（VS）策略，从大型化合物库中寻找N蛋白介导LLPS的小分子调控剂。
研究内容与结论：研究人员以SARS-CoV-2 N蛋白NTD与RNA复合物晶体结构（PDB ID: 7XWZ）为模型，通过Schr?dinger软件的Sitemap模块预测NTD-RNA界面的 putative binding pocket，对ChemDiv库（1,017,331个小分子）进行虚拟筛选。流程包括Glide SP分子对接、MM/GBSA重打分、聚类、类药性过滤和结合模式分析，最终获得23个候选化合物（D1–D23）。表面等离子体共振（SPR）实验显示化合物D21与N蛋白结合能力与对照化合物(?)-gallocatechin gallate（GCG）相当，且在100 μM浓度下表现出类似GCG的抗病毒活性和低细胞毒性。分子动力学（MD）模拟表明D21结合于NTD-RNA界面，通过π-π堆积与Tyr172相互作用，并增强RNA与N蛋白之间的距离，提示可削弱N蛋白-RNA相互作用。基于D21的结合模式，研究人员以槲皮素和杨梅素为起始原料，通过酯化反应引入苯环取代基，合成了系列I（槲皮素衍生物I1–I8）和系列II（杨梅素衍生物II1–II8）共16个衍生物。SPR结合分析显示，系列II化合物整体结合能力优于系列I，其中II8表现出最强亲和力（Kd = 1.84 μM），较GCG提高约11倍，较D21提高约14倍。MD模拟和自由能分解鉴定出Thr54、Tyr109、Ala55、Ala156等关键残基，突变模拟验证了这些残基对II8结合的重要性。抗病毒实验表明，II8在Vero细胞中EC50 = 26.6 μM，CC50 > 100 μM，选择性指数（SI）> 3.76，优于GCG（EC50 = 8.66 μM，CC50 = 20.8 μM）；在人体肺上皮Calu-3细胞中，II8的EC50 = 7.71 μM，CC50 > 100 μM，且Western blot和qRT-PCR证实其剂量依赖性地抑制N蛋白表达和病毒RNA拷贝数。时间加药实验和病毒灭活实验表明，II8主要通过直接灭活病毒粒子发挥作用——与病毒预孵育30分钟后，可使蚀斑形成减少99.4%。药代动力学（PK）研究显示，II8静脉注射后清除率高（CL = 2,428 mL/h/kg），半衰期短（T1/2 = 0.716 h），口服几乎不可测，提示其不适合全身给药。在K18-hACE2转基因小鼠模型中，II8以5、10、20 mg/kg剂量经鼻内给予（与病毒预孵育）均实现100%存活，并通过qRT-PCR证实其显著降低肺组织病毒RNA载量，效果优于对照药莫诺匹拉韦（MPV）。荧光恢复后光漂白（FRAP）和凝聚体抑制实验显示，II8在10 μM浓度下显著减少poly(I:C)诱导的N蛋白凝聚体的数目和大小，证实其抑制N蛋白介导的LLPS。
关键技术方法：研究采用了基于结构的虚拟筛选（VS）流程，包括Glide SP分子对接、MM/GBSA重打分和聚类分析；表面等离子体共振（SPR）技术测定化合物与N蛋白的亲和力；200 ns分子动力学（MD）模拟及MM/GBSA自由能分解分析结合模式；免疫荧光、Western blot、qRT-PCR和蚀斑实验评估抗病毒活性；K18-hACE2转基因小鼠模型（来自Jackson Laboratory）进行体内药效评价；FRAP和共聚焦显微镜观察相分离凝聚体动态。
研究结果分述：
（1）基于结构的VS靶向SARS-CoV-2 N蛋白：通过Sitemap预测NTD-RNA界面口袋，对ChemDiv库约101万个化合物进行多级筛选，获得23个候选化合物。
（2）VS命中化合物的生物学评价及D21的MD模拟：SPR显示D21结合能力与GCG相当；MD模拟表明D21与Tyr172形成π-π堆积，并增加RNA与N蛋白距离，为结构优化提供依据。
（3）目标化合物的化学合成：以槲皮素和杨梅素为原料，通过苄基保护、酯化、氢解去保护合成系列I和II共16个衍生物。
（4）目标化合物与SARS-CoV-2 N蛋白的结合分析：SPR显示系列II（杨梅素衍生物）结合更强，其中II8的Kd = 1.84 μM；MD模拟和突变验证了关键残基（Thr54、Ala55、Tyr109、Ala156等）的作用，酯基侧链占据额外空腔增强相互作用。
（5）目标化合物在细胞中的抗SARS-CoV-2活性：II8在Vero和Calu-3细胞中均表现出剂量依赖性抗病毒活性，且细胞毒性低；Western blot和qRT-PCR验证其抑制N蛋白表达和病毒RNA产生。
（6）II8降低SARS-CoV-2感染性：时间加药实验显示II8在“Co”和“Pre/Co”组显著降低病毒滴度，预孵育30分钟使蚀斑形成减少99.4%；直接病毒灭活实验表明100 μM II8可灭活约95%的感染性病毒颗粒。
（7）II8的体内PK研究：静脉注射2 mg/kg后，CL = 2,428 mL/h/kg，T1/2 = 0.716 h，Cmax = 979 ng/mL，远低于体外EC50；口服血药浓度低于检测限，提示需局部给药。
（8）II8在小鼠模型中的抗SARS-CoV-2药效：在致死性K18-hACE2小鼠模型中，II8经鼻内与病毒预孵育给药（5、10、20 mg/kg/天）均实现100%存活，肺组织病毒RNA显著下降，且未观察到体重或生存率的不良影响。
（9）II8对SARS-CoV-2 N蛋白LLPS的抑制：在HEK293T细胞中表达N-EGFP，poly(I:C)诱导形成具有流动性和融合行为的凝聚体（FRAP证实动态恢复）；10 μM II8或GCG显著减少凝聚体数目，表明II8通过破坏N-RNA凝聚体形成发挥抗病毒作用。
讨论与结论总结：当前COVID-19虽不再是全球公共卫生紧急事件，但SARS-CoV-2及其他人类冠状病毒仍地方性流行，且具有产生高传播性或高毒力变异株的能力。现有抗病毒药物如瑞德西韦（RDV）、奈玛特韦/利托那韦和莫诺匹拉韦存在耐药、治疗窗窄或不良反应等局限。本研究表明，基于结构的药物设计能够有效开发靶向N蛋白的LLPS调控剂。II8通过与N蛋白NTD高亲和力结合（Kd = 1.84 μM），破坏N蛋白-RNA凝聚体形成，从而抑制病毒复制。其作用机制主要涉及直接灭活病毒粒子中的N蛋白，在预防性局部应用中展示出潜力。然而II8的药代动力学特性差（半衰期约40分钟），目前更适合作为鼻喷雾剂等局部预防用药，而非全身治疗药物。未来需优化其代谢稳定性，以拓展其作为感染后治疗药物的可能性。研究结论指出，与常规N-NTD抑制剂相比，这类化合物遵循三项分子设计原则：分支结构单元、多环芳香核心和额外分支部分。这些结构特征促进与NTD的多重氢键相互作用，并形成高度一致的结合构象。II8可作为抗病毒药物开发的重要先导分子，为应对新发和再发冠状病毒提供治疗策略。
