《Journal of Agriculture and Food Research》：Study on the Dynamic Changes of Anthocyanins in Marselan (
Vitis vinifera L.) Grapes at the Northern Foot of Tianshan Mountains
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花色苷（anthocyanins）是自然界中广泛存在的天然水溶性色素，赋予植物根、茎、叶、花、果实及种子多种颜色。葡萄中常见的六种花色苷元包括天竺葵素（pelargonidin）、矢车菊素（cyanidin）、飞燕草素（delphinidin）、芍药素（peo
花色苷（anthocyanins）是自然界中广泛存在的天然水溶性色素，赋予植物根、茎、叶、花、果实及种子多种颜色。葡萄中常见的六种花色苷元包括天竺葵素（pelargonidin）、矢车菊素（cyanidin）、飞燕草素（delphinidin）、芍药素（peonidin）、矮牵牛素（petunidin）和锦葵素（malvidin）。自然界中大多数花色苷呈现红色至紫色色调，唯飞燕草素呈蓝红色或紫色。芍药素和锦葵素属于甲基化花色苷，在浆果、葡萄及红葡萄酒中含量丰富[1]。已有研究报道，葡萄及葡萄酒中的花色苷具有显著的保健功能，包括抗氧化、抗菌、抗病毒及清除自由基活性[2,3]，并对心血管疾病、肝损伤、癌症及诱变具有保护与预防作用[4]。
葡萄中花色苷的合成途径为苯丙烷–类黄酮途径（phenylpropane-flavonoid pathway），该途径是类黄酮生物合成途径的一个分支（包含三个部分），与其他植物花色苷具有相同的上游类黄酮合成途径[5]。苯丙烷–类黄酮合成途径的三个部分分别为：对香豆酰辅酶A（p-coumaroyl-CoA）的形成；对香豆酰辅酶A转化为三种二氢黄酮醇（二氢山柰酚（dihydrokaempferol, DHK）、二氢槲皮素（dihydroquercetin, DHQ）和二氢杨梅素（dihydromyricetin, DHM））；以及花色苷的特异性修饰（糖基化、甲基化和酰基化）[6]。葡萄中花色苷的积累需要环境因素与发育因素的复杂互作，其中糖分在成熟过程中持续积累，且已证实糖浓度与色素积累呈正相关[7]。查尔酮异构酶（chalcone isomerase, CHI）在转色中期强烈表达，因此花色苷开始快速积累，至成熟期浓度达到最高[8]。
自然界中游离花色苷极不稳定，碳水化合物残基通过C环C3位羟基连接至花色苷结构骨架上完成糖基化，其中3-O-葡萄糖苷是自然界中分布最广泛的形式。糖基化后，有机酸可连接至花色苷糖基的羟基上完成初步酰基化。用于酰基化的最常见有机酸化合物包括芳香酸和脂肪酸。酰基化可从两方面改变花色苷：在颜色方面，可见光范围内吸光度增加且最大吸收波长向长波方向移动；在稳定性方面，酰基产生的空间位阻可有效阻止水分子攻击，从而获得更稳定且颜色更深的花色苷形式[9]。值得注意的是，酰基化花色苷种类繁多，是酿酒葡萄中的主要花色苷。葡萄栽培方式和种植环境对花色苷合成中的重要催化酶具有显著影响，因此不同产区葡萄中花色苷的种类、相对比例及绝对含量存在显著差异[10-12]。
新疆天山北麓酿酒葡萄产区所处纬度与加利福尼亚和波尔多相近[13]。该区域昼夜温差大、日照时间长且强度大，土壤以沙质和/或砾质为主，为酿酒葡萄栽培提供了有利条件[14,15]。马瑟兰（Marselan）为该地区主栽品种，是由赤霞珠（Cabernet Sauvignon）与黑歌海娜（Grenache Noir）杂交育成的红色酿酒葡萄新品种。马瑟兰（Vitis vinifera L.）以颜色深、单宁丰富、香气浓郁[16]以及独特的黑色水果和香料气息为特征，正逐渐成为中国主要葡萄酒产区中具有发展潜力的葡萄品种[17]。新疆气候，尤其是葡萄成熟期间的气候，以昼夜温差大、日照强烈和降雨量少为特征[18]。研究人员推测这些气候条件促进了葡萄中糖分的快速积累，而有机酸水平可能在成熟后期被稀释，导致酸度相对较低[19]。因此，这种低酸条件严重限制了酰基化花色苷的形成，导致非酰基化花色苷（被认为不稳定）比例增加[20,21]。研究人员进一步推测，这些非酰基化花色苷在陈酿过程中或暴露于氧气时更容易发生降解和褪色，从而导致红葡萄酒陈酿潜力较低[22]。
为揭示新疆马瑟兰葡萄花色苷的动态变化及其生物合成中的关键物质，本研究首次利用CIELab色度法和液相色谱–电喷雾电离–串联质谱法（liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry, LC-ESI-MS/MS）对五个发育阶段的果皮颜色变化和花色苷代谢进行了表征。研究结果为缓解新疆葡萄酒严重褪色问题提供了理论依据，支持当地葡萄营养价值评估，并为未来育种策略提供指导。
天山北麓马瑟兰葡萄花色苷动态变化研究：论文解读
一、研究背景与问题提出
花色苷是自然界中广泛存在的天然水溶性色素，在葡萄中主要包括天竺葵素、矢车菊素、飞燕草素、芍药素、矮牵牛素和锦葵素六种花青素元。花色苷不仅赋予葡萄和葡萄酒丰富的色泽，还具有抗氧化、抗菌、抗病毒及清除自由基等健康功效，对心血管疾病、肝损伤和癌症具有保护作用。葡萄中花色苷的合成经由苯丙烷–类黄酮途径，包括对香豆酰辅酶A的形成、二氢黄酮醇的转化以及花色苷的糖基化、甲基化和酰基化等特异性修饰。游离花色苷极不稳定，糖基化和酰基化修饰可增强其稳定性和颜色深度。
新疆天山北麓产区纬度与加州和波尔多相近，具有昼夜温差大、日照强烈、降雨量少的气候特点，有利于酿酒葡萄栽培。马瑟兰为该地区主栽品种，由赤霞珠与黑歌海娜杂交育成，以颜色深、单宁丰富、香气浓郁著称。然而，新疆产区葡萄成熟期间糖分快速积累而有机酸被稀释，低酸条件严重限制了酰基化花色苷的形成，导致不稳定的非酰基化花色苷比例增加，进而造成红葡萄酒陈酿潜力低、易褪色等问题。因此，系统研究该产区马瑟兰葡萄发育过程中花色苷的代谢动态及其与品质性状的关联，对于改善新疆葡萄酒颜色稳定性、指导育种和栽培策略具有重要意义。
二、研究内容与主要结论
本研究以天山北麓马瑟兰葡萄为材料，依据改良Eichhorn-Lorenz（E-L）系统划分五个发育阶段，包括果实膨大期（SS，E-L 31–33）、转色期（CCS，E-L 35）、近成熟期（NMS，E-L 37）、成熟期（MS，E-L 38）和过熟期（OMS，E-L 39），采样时间为花后70至128天。研究人员首次结合CIELab色度法和液相色谱–电喷雾电离–串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）非靶向代谢组学技术，系统表征了五个发育阶段果皮颜色变化和花色苷代谢特征，揭示了花色苷积累规律、关键差异代谢物及其与糖、酸、酚类物质和果皮颜色的相关性。研究共鉴定出36种花色苷，发现锦葵素-3-O-半乳糖苷为成熟果皮中最丰富的花色苷，芍药素-3-O-(6″-乙酰半乳糖苷)为所有发育阶段的共有差异代谢物，碳水化合物和单体酚类物质可促进果皮花色苷生物合成。研究结果为缓解新疆葡萄酒褪色问题、评估当地葡萄营养价值及指导育种策略提供了理论基础。
三、关键技术方法
研究采用五点梅花采样法，在新疆天山北麓（86.23°E，44.30°N）葡萄园选取25株健康葡萄藤，于五个发育阶段（SS至OMS，花后70至128天）采集果实样品。主要技术方法包括：pH计和酸碱滴定法测定pH和可滴定酸（TA），数字折光仪测定可溶性固形物（SSC），DNS法测定还原糖；Folin–Ciocalteu法、Rouxinol法等测定总酚、总黄酮、总单宁和总花色苷；精密色度仪测定CIE L*a*b*颜色参数；超高效液相色谱（UPLC）和高效液相色谱（HPLC）分析可溶性糖和有机酸；UPLC分析单体酚类物质；LC-ESI-MS/MS非靶向代谢组学结合主成分分析（PCA）、K-means聚类、Mantel检验和Pearson相关分析进行花色苷鉴定与多变量数据分析。
四、研究结果
4.1 糖酸分析
果实发育过程中，可滴定酸（TA）逐渐降低而pH稳步升高，至过熟期达到峰值。总糖和可溶性固形物（SSC）从膨大期至转色期快速增加（总糖：7.90–119.78 mg/g；SSC：3.23–16.47 °Brix），近成熟期至过熟期平稳上升，与酸度呈相反趋势。成熟期葡萄pH和TA分别为3.85和1.57 mg/g。有机酸和可溶性糖分析共检测到四种酸和五种糖，其中酒石酸、苹果酸、葡萄糖和果糖占比最高。葡萄糖和果糖在转色期开始快速积累，至过熟期分别达到最大值104.24 mg/g和104.59 mg/g。奎宁酸在过熟期消失。
4.2 酚类物质分析
果皮中总酚在转色期降至最低，近成熟期达到最高后持续下降。总黄酮在转色期开始下降后持续快速增加，总单宁含量基本稳定。花色苷含量在转色期开始快速增加并持续上升至过熟期。共鉴定出12种单体酚，儿茶素和芦丁为果皮中主要单体酚。芦丁、香草酸、杨梅素、白藜芦醇和槲皮素在发育过程中持续增加，而表儿茶素、新绿原酸、咖啡酸和阿魏酸在膨大期含量最高。咖啡酸仅在膨大期和转色期检出，槲皮素在膨大期未检出。
4.3 CIE颜色参数
随着果实成熟，果皮颜色从膨大期绿色逐渐转变为转色期半绿浅紫色、近成熟期浅紫色，成熟期变为不透明深紫色，过熟期果皮因失水而皱缩。L*、a*和b*值均呈整体下降趋势。a*值在转色期由负转正，b*值在成熟期由正转负，蓝色比例显著增加。色度c*从膨大期至转色期降幅最大（11.44），过熟期略有增加。ΔE在转色期达到最大值18.96，对应绿色到红色的直接转变。色相角h从膨大期166.68（绿色）最终稳定在蓝紫色范围，表明马瑟兰果皮颜色以蓝紫色为主、红色调较少。
4.4 花色苷非靶向代谢组学
主成分分析（PCA）中PC1和PC2分别解释花色苷积累方差的61.7%和19.35%，不同发育阶段明显区分。共鉴定出36种花色苷，包括6种游离花色苷、11种单糖苷、6种双糖苷和13种酰基化花色苷。膨大期仅检出矢车菊素-3-O-芸香糖苷、矢车菊素-3,5-O-双葡萄糖苷和飞燕草素-3-O-接骨木二糖苷三种花色苷。几乎所有花色苷在转色期出现并增加，至成熟期达到最高含量，过熟期因环境因素部分花色苷含量下降。K-means聚类将代谢物分为六类。锦葵素-3-O-半乳糖苷为最丰富的花色苷，从膨大期26.88 μg/mL增至成熟期2566.59 μg/mL，占总量的50%以上，决定果皮特征性紫色。矮牵牛素-3-O-半乳糖苷为第二丰富的花色苷，转色期增加180倍。成熟期主要花色苷中仅三种为酰基化形式，总含量不足18%，显著低于波尔多等产区（>30%），这可能是新疆马瑟兰葡萄酒颜色稳定性较差的關鍵因素。
4.5 差异花色苷代谢物分析
基于差异倍数和变量投影重要性（VIP）值筛选差异积累花色苷。SS vs CCS比较组中35种花色苷下调，锦葵素-3-O-半乳糖苷为该比较组特有差异代谢物，可能是葡萄转色的关键物质。芍药素-3-O-(6″-乙酰半乳糖苷)为所有比较组共有的差异花色苷代谢物，可能在马瑟兰花色苷代谢中发挥重要作用。矮牵牛素为NMS vs OMS比较组特有差异代谢物，参与红色至紫色的转变。差异代谢物主要集中在九种花色苷，且几乎均为糖基化或酰基化形式，证实酰基化修饰在果皮着色中发挥关键作用。
4.6 花色苷代谢与品质性状相关性
Mantel检验和Pearson相关分析显示，飞燕草素-3-O-接骨木二糖苷、矢车菊素-3-O-芸香糖苷和矢车菊素-3,5-O-双葡萄糖苷与其他花色苷显著负相关。糖含量与36种花色苷中的28种显著相关（P < 0.05），有机酸仅与六种花色苷显著相关。果糖、葡萄糖、蔗糖和乳糖与单体花色苷均呈正相关，有机酸与游离花色苷呈负相关。12种单体酚与31种花色苷显著相关，其中表儿茶素、咖啡酸、阿魏酸和新绿原酸与单体花色苷负相关，槲皮素与单体花色苷正相关。芦丁、槲皮素和香草酸与12种酰基化花色苷均显著正相关。果皮色度与全部18种检测到的花色苷显著正相关（P < 0.05），与糖基化和酰基化修饰的花色苷分子相关性更显著。锦葵素-3-O-(6″-乙酰半乳糖苷)与L*极显著负相关（P < 0.01），是加速果皮变暗的关键花色苷。芍药素-3-O-(6″-乙酰半乳糖苷)和芍药素-3-O-(6″-丙二酰葡萄糖苷)与a*极显著正相关，对果皮红色呈现有显著贡献。所有酰基化花色苷均与ΔE正相关，在果皮颜色转变中发挥促进作用。
五、讨论与结论
讨论部分指出，新疆产区高温促进苹果酸呼吸消耗导致酸度降低，与已有研究结论一致。不同产区气候条件差异导致单体酚种类和含量存在显著差异，新疆产区葡萄采收期提前、糖含量升高、酸度降低和酚类积累不足，最终导致葡萄酒陈酿潜力下降。酰基化花色苷通过分子内辅色作用增强稳定性，而新疆产区酰基化花色苷比例偏低是葡萄酒颜色稳定性差的潜在原因。
研究结论表明，马瑟兰葡萄花色苷在转色后快速积累，成熟期达到峰值，过熟期略有下降。芍药素-3-O-(6″-乙酰半乳糖苷)为各发育阶段共有的核心差异代谢物，锦葵素-3-O-半乳糖苷为优势花色苷并主要决定浆果紫色。可溶性糖与花色苷积累的正相关性远强于有机酸，酰基化花色苷与深紫蓝色色调相关。研究鉴定了关键差异代谢物和优势花色苷，阐明了酰基化花色苷和芍药素衍生花色苷对颜色属性的贡献，建立了葡萄品质性状与花色苷组成及结构–颜色关系。这些发现为改善新疆地区葡萄酒颜色稳定性提供了候选代谢物和理论依据，并为提高葡萄颜色品质的育种和栽培策略提供了有价值的数据支持。
