《Small》：Engineering an Enzymatically Active Granular Matrix for On-Chip Modeling of Bone-Like Mineralization
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受控生物矿化（biomineralization）是构建生理相关硬组织模型的核心，然而在微流控芯片系统中实现空间有序的三维（3D）矿物沉积仍具挑战性。基于细胞的骨芯片平台虽具备生物学复杂性，但其将矿物起始与基质重塑及旁分泌信号耦合，使矿化最早期的生化驱动因素的
受控生物矿化（biomineralization）是构建生理相关硬组织模型的核心，然而在微流控芯片系统中实现空间有序的三维（3D）矿物沉积仍具挑战性。基于细胞的骨芯片平台虽具备生物学复杂性，但其将矿物起始与基质重塑及旁分泌信号耦合，使矿化最早期的生化驱动因素的分离变得复杂。受自下而上合成生物学（bottom-up synthetic biology）启发，研究人员设计了一种酶活性颗粒基质（enzymatically active granular matrix），在可灌流的3D微环境中重现关键成骨功能。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP），天然骨形成的关键驱动因子，通过硫醇-烯光化学（thiol–ene photochemistry）共价偶联至聚乙二醇基（poly(ethylene glycol)-based, PEG）微凝胶上，24 h后保留超过90%的初始活性。这些单分散微凝胶在芯片上组装成堵塞型（jammed）可灌流基质，实现对酶负载量和底物递送的独立调控。该系统支持原位矿化（24–48 h），产生缺钙、低结晶度的磷灰石样（apatite-like）物相，为早期骨矿物的特征。研究人员展示了酶活性在颗粒基质上的3D定位，结合间质灌流（interstitial perfusion），实现了空间分布取决于灌流模式的矿物形成。这一机制明确的无细胞平台为研究ALP驱动的3D矿化提供了可调基础，并为（病理）生理组织矿化的混合生物合成模型建立了模块化路径。
**研究背景与问题**
骨矿化是由成骨细胞通过空间区室化的酶活性精密调控的过程。成骨细胞表达碱性磷酸酶（ALP），该酶定位于细胞膜和基质囊泡，通过水解有机磷酸酯提高局部无机磷酸根浓度，促进磷酸钙成核。空间定位是该过程的关键，成骨细胞将矿化起始限制于特定膜和囊泡微域，而非允许非特异性体相沉淀。矿化的后续调控涉及基质囊泡介导的起始、细胞对离子微环境的调控以及胶原和非胶原蛋白对细胞外基质（ECM）的模板化作用。该空间调控过程的紊乱与骨质疏松症、骨软化症和低磷酸酯酶症等病理矿化相关。因此，早期骨样矿化的机制研究和靶向治疗开发需要能忠实重现这一空间定位、ALP驱动过程的体外平台。
近年来，器官芯片系统已成为可在受控条件下重现（病理）生理过程的微生理系统。骨芯片系统作为研究成骨、基质沉积和矿化的体外平台不断发展，已有多个基于细胞的骨芯片模型在2D及近期3D微环境中重现骨生物学。这些系统具有微尺度控制细胞复杂性、组织几何形状和培养条件等重要优势。然而，其对生物学复杂性的关注也限制了其分离矿化起始最早生化驱动因素的能力。基于细胞的系统本质上将酶驱动的矿化与基质重塑、旁分泌信号、分化状态和供体依赖性变异耦合，同时需要延长培养周期，制约了实验通量。这些过程虽对生理性骨形成至关重要，但难以独立变化以进行机制探究。因此，在这些平台中解析局部ALP活性对矿物成核和早期骨样矿化的具体贡献仍然具有挑战性。
无细胞矿化系统通过减少生物变异性和增强对物理化学条件的控制，提供了基于细胞模型的互补策略。直接掺入磷酸钙或生物活性玻璃等无机成分虽可重现矿物含量，但对成核动力学或矿物相空间结构的控制有限。ALP介导的系统因在近生理条件下重建骨矿化的核心生化驱动因素而特别有吸引力。近期研究已将酶诱导矿化整合到水凝胶、3D打印支架和植入物涂层中，以促进原位矿物形成并增强工程构建体的矿化能力。ALP功能化的PEG微粒先前已被组装成颗粒水凝胶，其中载酶构建块在体相构建体内产生矿化/非矿化界面。然而，此类颗粒基质迄今仅作为用于组织再生的静态体相支架开发，其作为可灌流芯片基质在受控底物传输下建模矿物形成的用途尚未被探索。
自下而上合成生物学和仿细胞材料的最新进展突出了区室化作为应对这一挑战的有前景途径。原始细胞和原始组织已表明生化反应可空间定位于可编程微尺度域，实现特定生物功能的选择性重建，同时降低生物学复杂性。仿细胞矿化材料进一步表明，局部催化环境和基质特性共同调控磷酸钙成核及矿物相的进一步成熟，在整合的原始细胞/基质复合体中实现自调控的钙化和脱钙。然而，此类系统作为静态体相构建体运行，并非设计为用于ALP驱动矿物形成机制建模的模块化可灌流芯片平台。
近年来，由微凝胶构建块组装的颗粒水凝胶已成为创建3D细胞培养基质的模块化生物材料。其固有的颗粒间微孔隙支持细胞浸润和分子传输而无需基质降解。此外，这些材料可表现出剪切稀化和自愈合行为，使其能够注入或加载到狭窄通道等受限几何形状中。这些特性使颗粒水凝胶成为器官芯片系统有吸引力的3D基质。然而，其作为工程基质在芯片系统中引导矿物形成的能力尚未被探索。
**研究内容与结论**
在此，研究人员报道了一种用于芯片上骨样矿化建模的酶活性颗粒基质。在该系统中，定位指ALP活性在可灌流颗粒基质尺度上的分布，而非暗示矿物形成限于单个微凝胶。为此，研究人员设计了带有共价偶联ALP酶的PEG基微凝胶作为3D基质组装的模块化构建块。这些微凝胶通过液滴微流控产生，并通过光引发硫醇-烯化学形成，实现水凝胶网络形成和酶在水凝胶相内同时偶联。在3D微流控腔室中物理堵塞后，这些构建块组装成可灌流颗粒基质，其中ALP固定于单个微凝胶内。该芯片平台实现了在受控可灌流3D环境中ALP驱动的矿化。研究结果表明24–48 h内快速矿化，72 h后鉴定出缺钙、低结晶度的磷灰石样物相，为早期骨矿物的特征。该系统还允许通过微凝胶设计和体外孵育条件的变化调控矿化。总之，这项工作在可灌流芯片平台内建立了一个机制明确的无细胞系统，用于ALP驱动矿化的体外建模，并为未来组织矿化的生物合成模型提供了可调基础。论文发表在《Small》。
**关键技术方法**
研究人员采用液滴微流控（droplet microfluidics）制备单分散PEG-降冰片烯（PEG-Nb）微凝胶，通过光引发硫醇-烯点击化学（thiol–ene click chemistry）同步完成水凝胶网络交联与硫醇化ALP（SH-ALP）的共价偶联；利用Traut试剂（2-iminothiolane）对ALP进行硫醇化修饰并经Ellman's assay定量游离硫醇；通过旋转流变学和毛细管流变学表征微凝胶悬液的剪切稀化与可注射性；将微凝胶物理堵塞组装于PDMS微流控芯片中央腔室（两侧以30 μm间距柱阵列分隔灌流侧通道），实现3D颗粒基质构建；采用顺序荧光染料标记（Calcein Blue/Green）追踪矿物沉积时序；结合X射线衍射（XRD）、衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、透射电子显微镜（TEM）、选区电子衍射（SAED）和电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）表征矿物物相与Ca/P比；并运用COMSOL Multiphysics进行流动与反应-扩散模拟。
**研究结果**
**2.1 ALP的硫醇化产生可调硫醇密度并保持酶活性**
研究人员采用光引发硫醇-烯点击化学进行水凝胶网络交联和ALP偶联，较传统碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）偶联更快速和选择性。由于牛肠ALP可及游离硫醇有限，ALP先经Traut试剂进行胺反应性硫醇化修饰。系统评估了Traut试剂浓度、pH和反应时间的影响：硫醇化程度随试剂浓度增加且依赖pH，在pH 8.0、20% v/v试剂、1 h条件下获得最高硫醇化度（每ALP约7.5个硫醇）。游离硫醇稳定性实验显示，室温下可检测硫醇从100%迅速降至3.0 h的约45%；?80°C储存保留约75%–80%可及硫醇。标准硫醇化条件设定为pH 8.0、20% v/v Traut试剂、室温1 h，每ALP产生约6–8个硫醇，硫醇化ALP于?80°C保存。
**2.2 ALP功能化PEG微凝胶具有酶活性并可组装成可注射颗粒基质**
原位光流变学证实PEG-Nb配方在UV暴露后约60 s内G′快速升高并平台化，最终储能模量2036 ± 4 Pa，tan δ为0.002，证实高效交联。微凝胶经液滴微流控制备，油相中微滴平均直径45.6 ± 1.9 μm，水相平衡溶胀后达61.1 ± 4.4 μm。ALP浓度从0增至2.0 mg mL?1使微滴直径从47.0 ± 4.1 μm增至72.0 ± 4.6 μm，但单分散性维持（CV < 12.2%）。活性评估显示单独UV暴露对ALP和SH-ALP活性无显著影响；UV+光引发剂+交联剂条件下ALP保留57.0 ± 5.0%、SH-ALP保留74.5 ± 1.0%活性；纳入水凝胶后ALP保留88.0 ± 4.9%、SH-ALP保留70.7 ± 1.3%。37°C孵育24和48 h后，共价偶联SH-ALP的水凝胶分别保留95.3 ± 6.4%和96.4 ± 35.1%初始活性，而物理包埋ALP仅保留61.1 ± 3.8%和61.0 ± 10.3%。Micro BCA assay显示洗涤后SH-ALP保留率约82.4%，72 h累积表观释放约4.8%。不同ALP浓度微凝胶经茜素红S染色显示浓度依赖性矿物沉积增加。旋转流变学显示微凝胶悬液在0.1–100 s?1范围内剪切稀化；毛细管流变学显示在5和10 mm s?1挤出速度下挤出压力分别为104.3 ± 14.5和102.3 ± 4.6 mbar，无堵塞或相分离，证实可注射性。
**2.3 ALP功能化微凝胶的芯片整合实现时间分辨、ALP依赖性矿物形成**
研究人员设计了中央腔室（1 × 5.4 × 0.35 mm）微流控芯片，两侧灌流侧通道以30 μm间距柱阵列分隔，实现微凝胶物理截留和连续侧向流体交换。微凝胶注射后在芯片内形成3D颗粒基质，颗粒间空隙约20 vol%，平均直径67 ± 5 μm，体积分数83.6 ± 8.8%。FITC-右旋糖酐（2 MDa）灌流证实颗粒间孔道网络可及。顺序荧光标记显示：5 h时荧光信号极少；29 h时颗粒基质内出现明显点状信号，表明微凝胶内空间分布成核；53 h时荧光强度显著增加，矿物特征增大，表明矿物域渐进生长和/或合并。ALP-free微凝胶对照荧光信号维持背景水平。1:1混合ALP功能化和ALP-free微凝胶实验显示Calcein信号在两者中均检测到，表明矿物沉积不限于载酶微凝胶，邻近ALP-free微凝胶通过共享介质获得的磷酸根支持矿物形成。摇板介导动态流与静态孵育比较显示：动态流条件下矿物形成偏好中央纵轴区域（中央20%区域矿物信号约为柱面附近区域的2.3倍），静态条件分布更均匀（中心-边缘比1.04）。流动与反应-扩散模拟预测微凝胶尺度以扩散传输为主（Péclet数≈0.1），反应-扩散长度约157 μm，Damk?hler数约10；微凝胶分辨模拟预测柱间隙开口处Pi局部降低约17%，与实验观察到的柱阵列邻近低矿化区域定性对应。
**2.4 矿物身份与纳米晶磷灰石样物相一致**
XRD支持低结晶度磷灰石形成：矿化微凝胶在约26.1°出现（002）反射，30.5°–34.5°出现（211）/（112）/（300）重叠宽包，与羟基磷灰石（HA）参考一致，展宽与纳米晶磷灰石相相符，c轴相干域约16–23 nm、横向4–7 nm。ATR-FTIR显示599和557 cm?1处ν4磷酸根弯曲振动分辨双峰，约1020 cm?1吸收增加及962 cm?1较小贡献，与HA参考偏差在6 cm?1以内；矿化样品无630 cm?1处OH?振动带，为低结晶度生物磷灰石典型特征。TEM显示数十纳米不规则电子致密聚集体由细针状亚特征组成；SAED呈连续环图案而非离散斑点，证实随机取向纳米微晶多晶组装，d间距3.42和约2.6 ?分别归属（002）和重叠（211）/（112）/（300）反射。ICP-OES测得Ca/P摩尔比1.34，低于化学计量HA的1.67，与缺钙非化学计量磷灰石一致。综合XRD磷灰石反射、FTIR分辨ν4 PO43?双峰和SAED离散环，沉积物归属为缺钙、低结晶度磷灰石样物相，其形成需要固定化ALP及其底物。
**讨论与结论**
该工作在可灌流芯片平台内建立了机制明确的无细胞系统用于ALP驱动矿化的体外建模。结果证实PEG基微凝胶共价偶联ALP后保留催化活性，在微流控腔室中组装成可灌流颗粒基质。通过将微凝胶相关ALP活性与灌流耦合，系统支持原位磷酸钙沉积，产生缺钙、低结晶度磷灰石样物相，与早期仿生矿物状态一致。矿物沉积虽限于酶活性颗粒基质，但混合微凝胶实验表明其不限于载酶微凝胶本身；ALP功能化微凝胶产生的磷酸根最可能扩散至仅数十微米远的邻近ALP-free微凝胶。流动与反应-扩散模拟进一步表明，与灌流侧通道的交换塑造了基质内Pi梯度，为流动相关矿化异质性提供了合理解释。该平台通过改变酶负载量、底物递送和灌流条件，支持在无细胞状态异质性、基质重塑和耦合生物信号条件下对矿化及其空间分布进行时间分辨研究。微凝胶基基质设计的模块化为未来增加芯片系统生物学复杂性创造了机会，例如酶活性微凝胶可与载细胞区室结合生成催化与细胞模块独立调节的混合生物合成模型。更广泛地，这项工作将酶活性微凝胶组装的可灌流颗粒基质确定为工程矿化组织模型的有前景设计原则。
