基于配方优化的脂质-氧化铁纳米颗粒在超高场MRI中评估胶质母细胞瘤异质性的渐近r2增强研究

《Small》：Asymptotic r2 Enhancement in Formulation-Optimized Lipid-Iron Oxide Nanoparticles for Assessing Glioblastoma Heterogeneity at Ultrahigh-Field MRI

　　

胶质母细胞瘤（GBM）仍是纳米医学面临的重大挑战，因为肿瘤血管生成异质性和血脑屏障导致纳米颗粒蓄积存在差异。本研究开发了脂质包覆超顺磁性氧化铁纳米颗粒（LSPIONs）作为MRI可见的脂质纳米载体，并建立了一种基于配方的策略以调控其横向弛豫率（r₂）。通过溶剂置换法将疏水性氧化铁纳米颗粒（IO@OA）掺入DSPC/胆固醇/DSPE-PEG脂质基质中，实现了对纳米颗粒尺寸、多分散性和SPION负载的系统性调控，在9.4 T下r₂值为13至418 mm^?1 s^?1。弛豫率对纳米颗粒尺寸（54–184 nm）和每个脂质纳米颗粒中估计的氧化铁纳米颗粒数量（237–9284）呈现渐近依赖性，揭示了一个饱和区域。在脂质与IO@OA摩尔比为8.3（DH = 98 nm，PDI = 0.14）条件下获得的最优配方在GL261-GFP同基因GBM小鼠模型中进行了评估。静脉给药后诱导GBM相关MRI信号的初始降低，在接种后1周和2周评估的肿瘤中于24 h可检测到肿瘤滞留。活体多光子显微镜进一步证实了LSPION的外渗和GBM蓄积。这些结果确立了r₂的配方调控作为MRI可见脂质纳米颗粒的关键设计策略，并为基于脂质的GBM成像纳米探针提供了实验框架。

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见且最具侵袭性的恶性原发性脑肿瘤，尽管采用标准治疗，中位生存期仍约为12–15个月。目前的治疗选择包括最大安全范围切除、替莫唑胺放疗以及免疫治疗、溶瘤病毒、CAR T细胞等新兴方法和联合策略。大多数先进的GBM治疗与脂质纳米颗粒（LNPs）作为药物递送系统相关，因其能够解决主要治疗障碍，特别是血脑屏障（BBB）穿透性差、肿瘤异质性和化疗、RNA治疗、基因编辑及免疫治疗的载荷递送受限等问题。LNPs已成为多功能且经临床验证的药物递送系统，其在mRNA COVID-19疫苗中的核心作用、已批准的siRNA治疗药物以及正在进行的基于CRISPR的药物的临床开发均体现了这一点。基于LNPs及相关脂质纳米载体的GBM治疗正在针对siRNA沉默、mRNA递送、CRISPR介导的基因编辑和化疗药物递送进行开发，包括将核酸与标准化疗药物联合的组合方法。临床前研究表明，可电离脂质化学、肽或抗体靶向以及给药途径等配方变量可显著影响GBM模型中的BBB穿透、肿瘤摄取、内体逃逸和治疗活性。然而，高效的肿瘤蓄积仍然是基于LNP的癌症治疗的主要瓶颈，因为纳米颗粒沉积受载体性质、蛋白冠和清除、血管异质性、细胞外基质屏障、靶向策略以及肿瘤类型和疾病阶段差异等多种因素影响。超顺磁性氧化铁纳米颗粒已被证明可通过诱导信号低信号作为有效的T₂加权MRI造影剂，其横向弛豫率（r₂）可通过尺寸、形貌、组成和表面涂层进行工程化调控，达到约90–680 mm^?1s^?1的值。较高的r₂值转化为更强的负对比度和更低铁剂量下的更高灵敏度，使r₂优化成为下一代氧化铁基MRI造影剂的核心设计目标。在此意义上，将氧化铁纳米颗粒掺入生物相容性脂质纳米载体以生成脂质包覆超顺磁性氧化铁纳米颗粒（LSPIONs）代表了一种开发MRI生物相容性造影剂的相关策略，因其高r₂弛豫率增强了T₂对比度、提高了低铁剂量下的灵敏度，并能够定量读取胶质瘤模型中纳米颗粒的蓄积情况。脂质或聚合物-脂质涂层还通过改善胶体稳定性、减少聚集和非特异性相互作用以及保持可偶联至胶质瘤相关受体的靶向功能，解决了氧化铁纳米颗粒的关键转化限制。LNPs可设计为成像兼容载体，利用荧光、核成像或MRI读数来定量体内肿瘤蓄积。其中，MRI尤其具有吸引力，因为它提供高空间分辨率和纳米颗粒分布的解解剖学分辨信息。LSPIONs可作为治疗性LNP制剂的潜在成像替代物，因为它们共享相同的脂质双分子层组成和表面设计，而这些是纳米颗粒生物分布的重要决定因素。然而，研究人员前期工作表明，氧化铁纳米颗粒的表面性质和相互作用强烈影响其作为T₂加权MRI造影剂的性能。这些发现强调了控制氧化铁纳米颗粒整合到脂质纳米载体中的重要性——从纳米颗粒-脂质界面的基础设计到其后续体内行为——以实现针对GBM的优化且具有临床相关性的诊疗一体化平台的开发。本研究中，研究人员通过调节有机相组成和脂质与SPION比例来研究氧化铁纳米颗粒整合到脂质纳米载体中以优化其T₂加权MRI对比性能。通过热分解法合成了窄尺寸分布的球形氧化铁纳米颗粒（7.9 ± 0.9 nm），并使用溶剂置换法将其掺入脂质纳米载体。配方参数的调节导致在9.4 T下r₂值为13至418 mm^?1 s^?1，揭示了r₂对颗粒尺寸的渐近依赖性，同时保持纳米颗粒尺寸在适合静脉给药的范围（<200 nm）内。随后在体内评估了优化配方在静脉给药后蓄积于GBM肿瘤的能力，在短期和长期时间点评估了肿瘤定位，并通过荧光成像和活体多光子显微镜进行了验证。总之，这些发现为下一代LSPIONs的设计和优化提供了合理的实验框架，用于MRI引导的应用。该论文发表在《Small》。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：通过热分解法合成油酸包覆的氧化铁纳米颗粒（IO@OA），并利用聚（马来酸酐-alt-1-十八烯）（PMAO）进行配体交换实现水相转移；采用溶剂置换法制备脂质包覆超顺磁性氧化铁纳米颗粒（LSPIONs），通过调节有机相中氯仿含量和脂质/IO@OA摩尔比系统优化配方；利用动态光散射（DLS）测定流体动力学直径（DH）和多分散性指数（PDI），透射电子显微镜（TEM）表征形貌，X射线衍射（XRD）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）验证结构，超导量子干涉装置（SQUID）磁强计表征磁学性质，电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）测定铁浓度；在9.4 T磁场下通过多切片多自旋回波（MSME）序列获取T₂参数图并计算r₂；使用GL261-GFP细胞立体定向植入7周龄雄性C57BL/6小鼠建立同基因GBM模型（样本队列来源：Creative Biolabs的GL261-GFP细胞）；通过T₂*多梯度回波（MGE）和T₂快速采集弛豫增强（RARE）序列进行体内MRI；采用活体多光子显微镜结合颅窗植入术评估纳米颗粒外渗和肿瘤蓄积；通过IVIS Spectrum进行离体生物分布评估。

研究结果如下：

2.1 脂质包覆氧化铁纳米颗粒的设计与表征：通过热分解法合成的IO@OA纳米颗粒呈高度球形，平均直径为7.92 ± 0.87 nm，多分散性低。XRD确认了氧化铁纳米颗粒的特征衍射图案，主要对应于具有立方尖晶石晶体结构的磁铁矿或磁赤铁矿。FT-IR验证了氧化铁的存在及油酸的成功表面功能化。磁性表征显示高饱和磁化强度（M_S = 80 emu g^?1），剩磁和矫顽力可忽略，阻塞温度（T_B）为64.5 K，证实了室温超顺磁性行为。IO@PMAO纳米颗粒的r₂达到81 mM^?1 s^?1。通过溶剂置换法合成的LSPIONs呈球形结构，IO@OA纳米颗粒分布于核心。氯仿含量影响有机相和水相中的粒径。脂质/IO@OA摩尔比为8.3 mol/mol时PDI最低（约0.14），DH为64 nm（33.3 mol/mol时）。ζ电位在pH低于7.4时接近中性或略负（约?5 mV），在高pH值下变得更负（约?20 mV），LSPIONs与无铁脂质纳米颗粒的pH依赖性ζ电位趋势相似。

2.2 脂质包覆氧化铁纳米颗粒的MRI表征：r₂随脂质/IO@OA摩尔比从5增至8.3 mol/mol而显著增加（从13至390 mm^?1 s^?1），进一步增加脂质含量则r₂逐渐降低至110 mm^?1 s^?1（33.3 mol/mol）。氯仿体积变化对r₂无显著影响，表明脂质含量而非有机相体积是LSPIONs MRI性能的关键决定因素。r₂对DH呈渐近关系，在较小粒径时急剧增加后逐渐趋于平台。基于理想密堆积假设（填充因子0.74）估计的理论最大IO@OA纳米颗粒数显示r₂与估计的封装IO@OA纳米颗粒数之间也呈渐近趋势。渐近r₂值分别确定为415 mm^?1 s^?1（尺寸依赖关系）和392 mm^?1 s^?1（颗粒负载依赖关系）。基于粒径、PDI和r₂的综合分析，脂质与IO@OA摩尔比为8.3 mol/mol被确定为最优配方（直径98 nm，PDI 0.14，r₂ 390 mm^?1 s^?1 at 9.4 T）。

2.3 胶质母细胞瘤模型中的体内MRI评估：在GL261-GFP细胞立体定向植入两周后评估LSPIONs的体内性能。静脉给药后肿瘤区域SNR显著降低，而对侧对照区域无显著变化。T₂*弛豫时间从21 ms降至10 ms，证实了LSPIONs在肿瘤组织中的高效蓄积及其在体内产生显著MRI信号强度降低和T₂*弛豫时间缩短的能力。在接种后1周和2周评估24 h肿瘤滞留，两个时间点肿瘤SNR均降低，2周时降低幅度略大（从18.7降至17.3 a.u.，而1周时从16.7降至15.5 a.u.）。T₂加权图像中ΔSNR在给药后仅有微小变化。T₂*加权图像中注射后ΔSNR增加，尤其在1周时，表明LSPIONs给药后T₂*加权图像中瘤内信号异质性增加。T₂*加权成像似乎比常规T₂加权成像对LSPIONs诱导的空间异质性信号变化更敏感。

2.4 活体多光子显微镜：使用DiD标记的荧光LSPIONs可视化其在大脑血管和肿瘤组织中的分布。静脉给药后立即在脑血管中检测到LSPIONs，24 h后在瘤周区域也检测到LSPION荧光，大部分信号定位于肿瘤边缘，并观察到LSPIONs与GFP阳性肿瘤细胞的共定位区域。定量共定位分析显示，给药1 h后12%的GFP阳性像素同时呈LSPION荧光阳性，24 h后显著增加至38.5%（p < 0.001）。Manders M2系数从1 h的0.12增加至24 h的0.37。Spearman秩相关系数从1 h的?0.10增加至24 h的0.29。共定位分析为LSPIONs在肿瘤接种2周后蓄积于GBM肿瘤中提供了额外证据，与MRI结果一致。

2.5 体内生物分布评估：DiD标记的LSPIONs在肿瘤接种14天后注射，24 h后处死小鼠，离体器官通过IVIS可视化。生物分布结果显示肝脏摄取最高，其次为脾脏和肾脏。大脑中也可见LSPIONs，但肿瘤中测得的荧光强度比肝脏低10倍。这些结果与无铁脂质纳米颗粒的生物分布一致，表明共享的脂质组成和表面设计有助于相似的器官蓄积特征，尤其是肝脏、脾脏和肾脏。

讨论部分总结：LNPs已成为多功能且有效的药物递送系统，在mRNA COVID疫苗、RNAi治疗药物Onpattro的批准以及基于CRISPR的治疗临床试验中得到体现。LNPs也被广泛研究用于GBM治疗，包括siRNA、mRNA和基于CRISPR的mRNA递送以及化疗药物。然而，基于LNP的治疗效果最终取决于其到达靶组织的能力。在GBM中，由于血脑屏障的异质性通透性和复杂的肿瘤微环境，肿瘤蓄积尤其具有挑战性。LNP蓄积的程度和空间分布取决于多种因素，包括纳米颗粒配方、靶向策略以及肿瘤类型和进展。因此，能够无创监测体内LNP蓄积的方法可为基于LNP的治疗的开发和优化提供有价值的信息。本研究开发的LSPIONs旨在重现治疗性LNPs的主要物理化学特征，同时提供强T₂/T₂* MRI对比度。LSPIONs保留了与常规治疗性LNPs相当的脂质基结构、尺寸范围和表面组成，而氧化铁纳米颗粒的掺入提供了内在的MRI对比机制。本研究的关键发现是MRI对比性能对LSPION尺寸和IO@OA纳米颗粒负载的强依赖性。优化配方达到约400 mm^?1s^?1的r₂弛豫率，表明将多个IO@OA纳米颗粒掺入单个LNP内可产生显著的T₂对比度。r₂对颗粒尺寸和脂质含量的依赖性为纳米颗粒结构与MRI性能之间的关系提供了重要见解。因此，确定了最佳脂质/IO@OA比率，在该比率下实现了IO@OA纳米颗粒的有效掺入，同时保持了有利的颗粒尺寸和胶体均匀性。在较低脂质含量下，LNP形成前IO@OA的聚集可能损害其有效掺入并导致r₂显著降低，而过量脂质尽管改善了配方条件却逐渐降低r₂。因此，控制脂质与IO@OA的比率提供了一种平衡IO@OA纳米颗粒掺入和每个LSPION磁性载荷的手段，最终决定MRI性能。具体而言，观察到r₂与颗粒尺寸和封装纳米颗粒数量之间均呈渐近关系，使得通过控制LSPION结构合理调节MRI对比性能成为可能。总之，这些结果表明LSPIONs的MRI性质受每个纳米颗粒内封装的磁性材料量的强烈支配。该关系与先前关于氧化铁负载脂质体和其他脂质基载体的研究一致，其中增加磁性纳米颗粒浓度通常导致r₂弛豫率增加和相应的T₂信号强度降低，尽管该关系可能最终因颗粒聚集或其他效应而达到饱和点。然而，r₂并非仅由总铁量决定。SPION尺寸、表面涂层、脂质组成、纳米颗粒结构和水可及性均可影响横向弛豫效率。例如，在磁性脂质体中，氧化铁纳米颗粒的限域可相对于自由分散的纳米颗粒增加r₂，可能归因于局部聚集和磁性纳米颗粒周围受限的水扩散。类似地，脂质室的组成和物理性质可影响氧化铁纳米颗粒负载和水交换，从而调节MRI对比度。本研究结果将这些观察扩展到脂质样纳米颗粒，并证明控制脂质纳米颗粒尺寸和组成的配方参数在氧化铁纳米颗粒掺入疏水核心时也直接影响其MRI性质。本研究观察到的趋势与研究人员前期工作中报道的功能关系一致，其中证明了r₂与偶极相互作用之间的渐近依赖性。这些发现证实该现象可转化为更现实和应用导向的纳米材料系统。本研究使用的策略不同于先前生成MRI可见LNPs的方法。钆基造影剂和氧化铁纳米颗粒先前已通过表面锚定造影剂或大幅修改载体内结构的方式掺入脂质纳米颗粒和脂质体中。氧化铁纳米颗粒已被掺入脂质双分子层、附着于纳米颗粒表面或封装在脂质体的水性核心中。尽管这些方法可提供有效的MRI对比度，但磁性材料定位于表面可能改变纳米颗粒表面性质、蛋白冠形成、生物分布并最终影响肿瘤蓄积。相比之下，本研究中氧化铁纳米颗粒被掺入LNP的疏水核心，未引入额外的表面配体或大幅修改脂质表面。这是通过使用油酸/油胺包覆的氧化铁纳米颗粒，利用疏水性纳米颗粒涂层与脂质组分烃链之间的相容性实现的。因此，该方法提供了一种引入高MRI对比载荷同时保持LNP外部特征的手段。配方过程对于实现氧化铁纳米颗粒的有效掺入也至关重要。通过溶剂置换或纳米沉淀法制备常规LNPs通常涉及将溶解在乙醇中的脂质与水相快速混合。由于本研究中使用的疏水性氧化铁纳米颗粒与乙醇或其他水混溶性溶剂不直接兼容，首先通过将疏水性组分溶解在氯仿中然后将该相分散在乙醇中来生成前体乙醇分散液。氯仿的量影响中间分散液的尺寸，并因此影响与水相混合后最终LSPIONs的尺寸。这些观察结果强调了在调整常规LNP制造程序以掺入疏水性磁性纳米颗粒时控制疏水相物理化学状态的重要性。高r₂弛豫率转化为体内可测量的MRI对比度。静脉给药后，观察到T₂*加权信号的快速降低，表明LSPIONs到达脑肿瘤并产生足够的局部磁化率以改变MRI信号。然而，24 h时T₂信号降低的幅度与给药后立即观察到的显著对比度相比相对适中。这一观察与先前使用氧化铁基系统进行脑肿瘤成像的研究一致，可能反映后期时间点肿瘤内保留的LSPIONs浓度相对较低。特别是，肿瘤核心特有的高度高信号T₂信号可能掩盖LSPION蓄积引起的相对较小的信号降低。此外，LSPIONs未功能化主动靶向配体，因此其蓄积预期主要取决于肿瘤的血管和微环境特征。解释纵向MRI结果的另一个考虑因素是重复给药后LSPIONs的潜在持久性。由于同一动物以一周间隔接受了两次注射，第一次给药的残留纳米颗粒可能对第二次注射前测量的基线MRI信号有所贡献。因此，第二周观察到的MRI信号可能反映新给药和先前保留的纳米颗粒以及肿瘤进展相关变化的共同作用。尽管如此，在每个时间点使用配对的注射前和注射后测量允许评估每次给药后的额外对比度变化，同时最小化预先存在的信号差异的影响。尽管不能完全排除残留LSPIONs的贡献，但结果与肿瘤内纳米颗粒相关的MRI对比度变化一致。此外，MRI发现得到活体多光子显微镜的支持，后者证明了LSPIONs存在于瘤周区域并随时间与GFP阳性肿瘤细胞的关联增加。两种成像模式提供的互补信息支持MRI信号变化反映肿瘤内纳米颗粒蓄积而非仅瞬态血管循环的解释。肿瘤边缘周围的优先蓄积与GBM的异质性血管通透性和细胞外结构一致，表明该LSPION平台可能特别适用于研究LNP在肿瘤微环境中的空间分布。生物分布特征进一步表明LSPIONs在静脉给药后主要蓄积于肝脏。该模式与许多LNP制剂的已建立生物分布一致，这些制剂被单核吞噬细胞系统快速清除并优先蓄积于肝脏和脾脏。与常规LNPs一样，这种分布受颗粒尺寸、表面化学和与血清蛋白相互作用的影响。LSPIONs与LNP系统通常报道的生物分布之间的相似性进一步支持其作为成像替代物的潜在用途。总之，这些发现表明将氧化铁纳米颗粒掺入LNP样纳米颗粒的疏水核心可提供高r₂弛豫率，同时保持研究LNP生物分布所需的物理化学特征。r₂对纳米颗粒尺寸和氧化铁纳米颗粒负载的强依赖性也为优化MRI灵敏度提供了有用的配方参数。重要的是，MRI和活体多光子显微镜的结合使得能够进行无创纵向监测和纳米颗粒定位的高分辨率评估。因此，这种多模态方法对于评估LNP制剂的肿瘤递送和生物分布以及最终指导基于LNP的GBM治疗策略的开发可能具有价值。

研究结论部分翻译：本研究中，研究人员开发了脂质包覆超顺磁性氧化铁纳米颗粒（LSPIONs）作为MRI可见的LNP样系统，并建立了一种基于配方的方法来调控其横向弛豫率。脂质含量和有机相组成的系统性变化使得能够调节纳米颗粒尺寸和氧化铁纳米颗粒掺入，导致r₂超过一个数量级的变化。重要的是，r₂对两个参数均呈现渐近依赖性，揭示了一个饱和区域，超过该区域进一步增加提供有限的MRI性能增益。体内MRI和活体显微镜证明了LSPIONs在GBM肿瘤中的蓄积和滞留。总之，这些发现确立了r₂的配方调控作为MRI可见脂质基纳米载体的关键设计策略，并为下一代脂质基磁性纳米载体的合理开发提供了框架。