《Journal of Biological Chemistry》：Snapshots of ATP-driven substrate translocation by the mitochondrial AAA+ protease AFG3L2
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AFG3L2定位于线粒体内膜，是一种由ATP驱动的蛋白酶，负责蛋白质降解，其功能障碍与多种神经退行性疾病相关。然而，其ATP驱动底物易位的结构基础尚不完全清楚。在本研究中，研究人员纯化了全长人AFG3L2，并测定了其在四种不同构象状态（Con1–Con4）下的
AFG3L2定位于线粒体内膜，是一种由ATP驱动的蛋白酶，负责蛋白质降解，其功能障碍与多种神经退行性疾病相关。然而，其ATP驱动底物易位的结构基础尚不完全清楚。在本研究中，研究人员纯化了全长人AFG3L2，并测定了其在四种不同构象状态（Con1–Con4）下的冷冻电镜（cryo-EM）结构，揭示了底物在核心催化结构域中的结合，尽管其跨膜结构域的电子密度较弱。这些结构显示出一种不对称的螺旋阶梯架构，其中六个原体围绕一个容纳多肽底物的中央孔道排列。四种构象状态共同揭示了一种底物易位机制，其中顶部原体的ATP结合促进底物结合，而底部ATP结合原体的ATP水解导致底物释放。研究人员的发现提供了AFG3L2由ATP驱动底物易位的结构快照，并通过揭示有序ATP酶循环过程中的底物捕获和释放，细化了手递手易位机制。
研究背景：细胞蛋白质稳态的维持依赖于复杂的蛋白质质量控制体系，以确保蛋白质折叠保真度、清除受损或错误折叠的蛋白质并调节蛋白质周转。这些体系的失效会导致异常蛋白质积累，从而损害细胞功能。在主要蛋白质质量控制体系中，AAA+（与多种细胞活动相关的ATP酶）蛋白酶在细菌和真核生物中进化保守，在维持蛋白质组稳态中发挥核心作用。AAA+蛋白酶由ATP水解驱动，将蛋白质底物去折叠并将产生的多肽通过中央孔道易位至自区室化的蛋白水解腔内进行降解。两类AAA+蛋白酶——m-AAA和i-AAA——定位于线粒体内膜，维持线粒体蛋白质稳态。它们共享保守的结构域架构，包括N端结构域（NTD）、跨膜区、AAA+ ATP酶结构域和锌金属蛋白酶结构域。m-AAA蛋白酶的催化结构域朝向线粒体基质，而i-AAA蛋白酶的催化结构域暴露于膜间隙（IMS）。在人类中，m-AAA蛋白酶组装为AFG3L2原体的同源六聚体或AFG3L2与paraplegin（由SPG7编码）原体的异源六聚体。AFG3L2介导异常线粒体蛋白的清除，并参与特定线粒体蛋白的加工，从而调控多种线粒体功能，包括钙稳态、线粒体核糖体组装、线粒体动力学和氧化还原稳态。在哺乳动物中，AFG3L2缺陷导致线粒体功能障碍，包括线粒体碎片化、膜电位降低、呼吸受损和神经元细胞死亡。此外，AFG3L2的疾病相关变异与人类神经退行性疾病相关，最显著的是脊髓小脑共济失调28型（SCA28）。此前的NMR结构研究揭示了AFG3L2的膜间隙结构域（IMSD；残基164–251）采用βαβββαβ折叠。此外，截短型人AFG3L2构建体（残基272–797）的冷冻电镜研究表明，基质暴露的AAA+ ATP酶结构域在平面六聚体蛋白酶环上方形成不对称螺旋。然而，全长AFG3L2的结构仍未解析，底物识别、易位和降解的动态机制仍不清楚。因此，研究人员开展了本研究，旨在解析全长AFG3L2的结构并阐明其ATP驱动底物易位的分子机制。
研究人员通过人胚胎肾（HEK）293F细胞表达系统成功获得了全长AFG3L2复合物，并表征了其ATP酶和蛋白水解活性。利用冷冻电镜（cryo-EM），研究人员测定了底物结合的AFG3L2的四种结构，分别采用不同的构象状态（Con1–Con4），分辨率分别为3.3 ?、3.4 ?、2.9 ?和3.0 ?。这些结构揭示了不对称六聚体组装，其中六个原体围绕中央孔道排列以容纳多肽底物。结构分析表明，顶部原体的ATP结合促进底物重新结合（如Con1–Con3所示），而底部ATP结合原体的ATP水解参与底物释放（如Con4和Con1所示）。研究人员的工作提供了AFG3L2由ATP驱动底物易位的结构快照，并通过定义有序ATP酶循环中空间分离的底物捕获和释放事件，细化了手递手模型。这些发现对于理解AFG3L2的催化机制及其在神经退行性疾病中的病理作用具有重要意义。
关键技术方法：研究人员利用HEK293F细胞表达系统表达了全长人AFG3L2及其变体（ATP酶缺陷型AFG3L2E408Q、蛋白酶失活型AFG3L2E575Q及双变体AFG3L2E408Q/E575Q），并通过亲和层析和尺寸排阻色谱纯化了蛋白质复合物。采用孔雀石绿磷酸盐测定法检测ATP酶活性，采用荧光肽裂解测定法检测蛋白水解活性。利用冷冻电镜（cryo-EM）技术收集数据，并通过cryoSPARC进行数据处理和三维重建，最终通过PHENIX和Coot进行模型构建和精修。
研究结果：
结构表征：研究人员通过冷冻电镜解析了AFG3L2E408Q/E575Q双变体在AMPPNP存在下以及AFG3L2E408Q/E575Q-MAIP1复合物的结构，获得了四种构象状态（Con1–Con4），分辨率分别为3.3 ?、3.4 ?、2.9 ?和3.0 ?。所有结构均显示不对称组织，由两个堆叠的环组成，即C6对称的蛋白酶环和螺旋阶梯状ATP酶环。在ATP酶环的中央孔道内观察到额外的电子密度，可建模为11个残基的未折叠多肽，可能代表纯化过程中捕获的内源性底物。每个结构包含六个原体围绕中央孔道排列，每个原体在ATP酶螺旋阶梯中占据不同的垂直位置。
核苷酸状态：通过分析核苷酸结合口袋的密度，研究人员确定了各原体的核苷酸状态。四种结构代表不同的构象状态：Con1中P1–P6的核苷酸占据为apo–ATP–ATP–ATP–ADP–apo，Con2和Con3均为ATP–ATP–ATP–ATP–ADP–apo，Con4为ATP–ATP–ATP–ATP–apo–apo。Con1代表ATP结合前的中间态，Con4中P5的ADP释放表明ATP酶循环中ADP释放发生在P5。ISS基序（439DGF441）在P3、P4和P5中采用延伸构象，与其相邻原体P2、P3和P4的ATP结合相关，表明环周围存在传播性原体间偶联模式。
底物易位：AFG3L2的中央孔道由两个底物相互作用环——孔道环1和孔道环2——衬里。孔道环1采用螺旋阶梯架构环绕底物多肽。P2–P5的孔道环1接触底物，其中芳香族残基F381直接接触底物主链并介导底物结合。F381突变为丙氨酸显著降低蛋白水解活性，强调了该保守芳香族孔道环残基在底物结合中的关键作用。在Con1和Con2中，P1占据最高位置但其孔道环1未与底物结合；而在Con3和Con4中，P1的孔道环1直接接触底物。这些结构捕获了P1从底物未结合到结合状态的转变。P6的孔道环1在所有四种构象中均与底物分离，占据阶梯底部和顶部之间的中间位置，表明P6处于预结合中间态。这些结构支持AFG3L2的连续底物易位机制，其中P1在ATP结合后经历结合与未结合的循环，P2–P5保持底物结合以维持连续抓握，P6在返回螺旋阶梯顶部启动下一步易位前经历重置。
底物降解：AFG3L2的蛋白酶环位于ATP酶环下方，包含六个锌依赖性金属蛋白酶活性位点，位于环的内周。这些活性位点由α10中HEXXH基序的H574和H578以及α12中的D648形成，直接配位Zn2+离子。在Con4中，两个底物肽密度穿过P2和P3位置的蛋白酶活性位点，建模为两个8残基多聚丙氨酸肽。底物形成与β7相邻的额外β链，将多肽定位在锌依赖性活性位点附近进行蛋白水解切割。
讨论部分总结：本研究获得了全长AFG3L2并测定了其四种不同构象状态的冷冻电镜结构。ATP酶和蛋白酶结构域解析良好，而NTD和TMD解析较差，这与先前解析的FtsH家族结构一致，反映了膜相关区域的内在构象灵活性。先前的发现支持ATP水解是底物易位的主要驱动力；本研究获得的四种构象状态支持顺序ATP水解模型。冷冻电镜结构进一步揭示底物结合的AFG3L2表现出不对称核苷酸循环过程，不同原体可同时占据不同的核苷酸状态。这种不对称性为不同底物易位阶段相关的多种构象中间体的共存和捕获提供了结构基础。重要的是，Con1–Con4的顺序分配应被视为提出的结构模型而非直接建立的时间序列。此外，MAIP1可能影响AFG3L2的构象状态。AFG3L2活性受多种相互作用因子调控，但这些辅因子介导调控的结构基础仍不清楚。未来对AFG3L2与底物和调控辅因子的复合物进行结构研究将有助于阐明底物识别、ATP酶协调和蛋白水解活性如何在该线粒体蛋白水解系统中整合。
研究结论翻译：AFG3L2定位于线粒体内膜，是一种由ATP驱动的蛋白酶，负责蛋白质降解，其功能障碍与多种神经退行性疾病相关。然而，其ATP驱动底物易位的结构基础尚不完全清楚。在本研究中，研究人员纯化了全长人AFG3L2，并测定了其在四种不同构象状态（Con1–Con4）下的冷冻电镜结构，揭示了底物在核心催化结构域中的结合，尽管其跨膜结构域的电子密度较弱。这些结构显示出一种不对称的螺旋阶梯架构，其中六个原体围绕一个容纳多肽底物的中央孔道排列。四种构象状态共同揭示了一种底物易位机制，其中顶部原体的ATP结合促进底物结合，而底部ATP结合原体的ATP水解导致底物释放。研究人员的发现提供了AFG3L2由ATP驱动底物易位的结构快照，并通过揭示有序ATP酶循环过程中的底物捕获和释放，细化了手递手易位机制。
