《Journal of Biological Chemistry》：The myeloid transcription factor PU.1 acts through three distal and proximal enhancers to drive
TNF induction in human alveolar macrophages
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巨噬细胞通过Toll样受体（TLR）信号被感染激活，并产生包括肿瘤坏死因子（TNF）在内的促炎性细胞因子。然而，在人类巨噬细胞中调控TNF转录的增强子尚未得到充分研究。本研究利用下一代测序方法，在原代人肺泡巨噬细胞中鉴定了TNF基因座周围131 kb区域内的六
巨噬细胞通过Toll样受体（TLR）信号被感染激活，并产生包括肿瘤坏死因子（TNF）在内的促炎性细胞因子。然而，在人类巨噬细胞中调控TNF转录的增强子尚未得到充分研究。本研究利用下一代测序方法，在原代人肺泡巨噬细胞中鉴定了TNF基因座周围131 kb区域内的六个候选增强子。其中三个增强子——远端-16kbTNF、-7.1kbTNF和近端增强子PETNF——在TLR3刺激后直接调控TNF转录。缺失远端-16kbTNF增强子导致poly(I:C)刺激下TNF基因转录减少73%。此外，缺失-7.1kbTNF增强子使TNF mRNA减少41%，而缺失PETNF增强子则使其减少52%。高通量报告基因分析鉴定出驱动增强子活性的DNA片段。对转录因子结合基序的突变分析揭示，PU.1结合位点是增强子活性所必需的。进一步分析表明，PU.1而非EGR1或AP-1是调控TNF增强子活性和TNF转录的主要调控因子。本研究证明PU.1在驱动人巨噬细胞TNF增强子活性和mRNA表达中发挥关键作用。
研究背景与问题：巨噬细胞是机体抵御病原体的第一道免疫防线，通过Toll样受体（TLR）识别病原体并启动炎症反应。TLR3可被病毒双链RNA类似物poly(I:C)激活，诱导巨噬细胞产生大量TNF-α等促炎细胞因子。然而，TNF-α的过度产生会导致严重感染中的组织损伤以及癌症免疫治疗中的毒性效应。尽管TNF基因在免疫应答中至关重要，但调控人类巨噬细胞中TNF基因表达的增强子及其相关转录因子仍不清楚。增强子通常位于非编码区，可远离转录起始位点（TSS）超过100 kb，且常跨越其他基因，传统的“最近基因”注释方法容易遗漏远端增强子；染色质构象捕获技术虽可发现远端相互作用，但无法判断这些增强子对靶基因转录的相对贡献。因此，亟需系统鉴定并功能验证人类巨噬细胞中调控TNF转录的增强子及其关键转录因子。
研究人员开展的研究与结论：研究人员利用H3K27ac ChIP-seq和Omni-ATAC-seq，在原代人肺泡巨噬细胞（AM）中鉴定了TNF基因TSS上下游共131 kb区域内的六个候选增强子（-41.1 kb至+90.4 kb），命名为PETNF、-33kbTNF、-16kbTNF、-7.1kbTNF、+44kbTNF和+85kbTNF。通过条形码慢病毒报告基因实验，发现其中五个区域具有增强子活性。利用改良的CRISPR/Cas9四向导RNA（分别携带BFP、GFP、RFP和Thy1.1标记）结合FACS分选方法，在PMA成熟的THP-1细胞中实现了候选增强子的纯合敲除。功能实验表明，缺失-16kbTNF、-7.1kbTNF和PETNF分别使poly(I:C)诱导的TNF mRNA表达减少73%、41%和52%，而缺失-33kbTNF和+85kbTNF不影响TNF转录，但分别影响DDX39B和C6orf47/GPANK1的表达。大规模平行报告分析（MPRA）和扫描突变分析将-16kbTNF增强子的关键功能区域缩小至包含PU.1/EGR1和AP-1结合位点的片段。进一步通过CRISPR敲除SPI1（编码PU.1）、EGR1和cFos，发现仅PU.1缺失导致TNF mRNA减少约83%，证实PU.1是关键调控因子。PU.1 ChIP-qPCR显示PU.1在静息和刺激条件下均结合于-16kbTNF、-7.1kbTNF和PETNF，且poly(I:C)刺激显著增强其在-16kbTNF上的招募。荧光素酶报告实验证明PU.1过表达可驱动三个增强子活性，而突变PU.1结合位点显著削弱该活性。该研究揭示了PU.1通过直接结合多个增强子协同驱动TNF转录的调控网络，为炎症相关疾病的干预提供了潜在分子靶点。
主要关键技术方法：研究使用了以下核心技术：1）H3K27ac ChIP-seq和Omni-ATAC-seq鉴定活性增强子；2）条形码慢病毒大规模平行报告分析（lentiMPRA）检测增强子活性；3）改良的四向导RNA CRISPR/Cas9基因编辑结合FACS分选实现纯合缺失；4）PU.1 ChIP-qPCR检测转录因子结合；5）双荧光素酶报告基因实验验证增强子功能。样本来源包括7例原代人肺泡巨噬细胞（来自器官捐献者肺灌洗液）以及THP-1细胞系（ATCC）。原始数据已提交至GEO（GSE226158）。
研究结果：
1. 鉴定响应poly(I:C)刺激的候选TNF增强子：时间进程实验显示TNF mRNA在poly(I:C)刺激4小时后显著升高，8小时达峰值（104.8倍）。对刺激4小时的AM进行H3K27ac ChIP-seq和Omni-ATAC-seq，在TNF TSS ±100 kb内鉴定出六个候选增强子，并发现Hi-C数据提示-16kbTNF与-7.1kbTNF和PETNF之间存在染色质接触。
2. -33kbTNF、-16kbTNF、-7.1kbTNF、PETNF和+85kbTNF区域具有显著报告基因活性：在PMA成熟的THP-1细胞中，利用条形码慢病毒报告系统检测五个区域（除+44kbTNF外）均显示显著增强子活性，而非增强子对照则无活性。
3. -16kbTNF、-7.1kbTNF和PETNF增强子在染色质环境中显著促进poly(I:C)刺激下的TNF基因转录：通过四向导RNA CRISPR删除各候选增强子，发现-16kbTNF缺失使TNF mRNA减少73%，-7.1kbTNF缺失减少41%，PETNF缺失减少52%；而-33kbTNF和+85kbTNF缺失不影响TNF转录。第二组sgRNA验证得到一致结果。
4. PU.1结合位点对于驱动-16kbTNF增强子活性至关重要，且PU.1调控TNF基因表达：MPRA和扫描突变分析确定SM-3（含PU.1/EGR1位点）和SM-6（含AP-1位点）为关键功能片段。CRISPR敲除实验显示仅缺失PU.1使TNF mRNA减少83%，EGR1或cFos缺失无显著影响。
5. PU.1结合于PETNF、-7.1kbTNF和-16kbTNF增强子：PU.1 ChIP-qPCR证实PU.1在静息和poly(I:C)刺激下均富集于三个增强子，且刺激后-16kbTNF上PU.1结合显著增加2.1倍。
6. PU.1通过直接结合其结合位点驱动三个增强子活性：荧光素酶报告实验显示PU.1过表达使-16kbTNF、-7.1kbTNF和PETNF活性分别增加20.3倍、9.0倍和7.0倍。通过STREME和FIMO预测并突变PU.1基序，发现突变BS1PE、BS1-16、BS2-16、BS1-7.1、BS2-7.1和BS3-7.1可使PU.1驱动的增强子活性降低63%–76%，而BS2PE突变无影响。
讨论与结论：该研究解决了增强子-靶基因归属的难题。传统近端基因注释会将-33kbTNF和+85kbTNF误归为DDX39B和C6orf47的启动子，而实验证明它们虽具启动子/增强子活性但不调控TNF。真正调控TNF的是-16kbTNF、-7.1kbTNF和PETNF。值得注意的是，-7.1kbTNF与已知的hHS-8调节元件重叠，而-16kbTNF位于LTA和LTB基因之间但不影响这两个基因的表达。研究还发现PU.1作为谱系决定转录因子，在静息状态下已结合增强子，刺激后PU.1在-16kbTNF上招募增加，表明PU.1兼具信号依赖性转录因子功能，将TLR3信号传递至增强子并组装高阶转录复合物。本研究的局限性在于仅分析了TNF TSS ±100 kb窗口，可能遗漏更远的染色质环状相互作用增强子。总之，鉴定出三个功能性TNF增强子并证明PU.1是核心调控因子，为靶向TNF相关疾病的治疗提供了潜在分子靶点。结论翻译：本研究揭示了近端和远端增强子通过PU.1介导的机制协同驱动TNF转录的调控网络，为理解人类巨噬细胞中炎症基因调控提供了机制性见解。
