人源ADP-核糖基受体水解酶3逆转丝氨酸单ADP-核糖基化的结构与动力学机制

《Journal of Biological Chemistry》：Structural and kinetic basis of serine mono-ADP-ribosylation reversal by human ADP-ribosyl-acceptor hydrolase 3

　　

丝氨酸单ADP-核糖基化（Ser-MARylation）由聚(ADP-核糖)聚合酶1/2（PARP1/2）-组蛋白PARylation因子1（HPF1）复合物催化，并由ADP-核糖基受体水解酶3（ARH3）逆转，是人体细胞中DNA损伤诱导的ADP-核糖基化的主要形式。与PARylation不同，Ser-MARylation代表DNA损伤后关键的“第二波”信号。Ser-MARylation的失调与神经退行性疾病和癌症相关，ARH3缺陷可驱动PARP抑制剂治疗耐药。然而，由于缺乏明确的蛋白质底物和灵敏的定量工具，Ser-MARylation逆转的机制表征一直受阻。本文报道了一种定量检测方法，利用丝氨酸MAR化的HPF1（Ser-MARylated HPF1）作为特异性、明确的底物，监测ARH3介导的蛋白质连接Ser-MARylation的逆转。引人注目的是，ARH3对Ser-MARylated HPF1的动力学偏好性比MARylated PARP1高200倍以上。通过使用一组ADP-核糖类似物，研究人员鉴定出ADP-HPD是一种有效的ARH3抑制剂，可模拟O-糖苷键水解的环氧碳正离子样过渡态。结合结构和突变分析，这些发现支持一个催化机制，其中Asp77激活催化水分子对丝氨酸-ADP-核糖可切割键进行亲核攻击。总体而言，这项工作建立了Ser-MARylation逆转的机制框架，并为合理的ARH3抑制剂开发奠定了基础。

人源ADP-核糖基受体水解酶3逆转丝氨酸单ADP-核糖基化的结构与动力学机制解读

**研究背景与问题**
ADP-核糖基化是一种可逆的翻译后修饰，在DNA损伤应答、染色质重塑和细胞命运决定中发挥关键作用。聚(ADP-核糖)聚合酶1（PARP1）结合DNA断裂后迅速激活，催化从NAD⁺转移单或聚ADP-核糖单元到靶蛋白。丝氨酸是DNA损伤后PARP1/2介导ADP-核糖基化的主要受体残基，丝氨酸连接的单ADP-核糖基化（Ser-MARylation）不同于聚ADP-核糖基化（PARylation），构成DNA损伤信号中的“第二波”反应。Ser-MARylation依赖辅助蛋白HPF1，其与PARP1形成复合物并将底物特异性转向丝氨酸。该修饰的逆转由两种酶完成：聚(ADP-核糖)糖水解酶（PARG）降解PAR链，ADP-核糖基受体水解酶3（ARH3）是唯一已知水解Ser-MARylation的酶。ARH3缺陷与神经退行性疾病、氧化应激敏感性增加、与PARG抑制的合成致死以及PARP抑制剂治疗耐药相关。然而，此前缺乏明确的蛋白质底物和灵敏定量工具，阻碍了Ser-MARylation逆转的机制研究。已有研究依赖自发修饰的PARP1/2、合成肽或非蛋白质底物，难以精确表征ARH3催化机制。此外，尚无靶向ARH3活性位点的特异性抑制剂。

**研究内容与结论**
研究人员开发了一种灵敏且选择性的检测平台，使用Ser-MARylated HPF1作为明确底物监测ARH3介导的蛋白质连接Ser-MARylation逆转。通过PARG处理ADP-核糖基化的HPF1，保留蛋白质近端的丝氨酸连接单ADP-核糖部分，生成仅含丝氨酸MAR化的HPF1底物。研究证实HPF1主要被PARP1/2在丝氨酸残基上ADP-核糖基化，且Ser-MAR-HPF1是ARH3的优越底物。ARH3对Ser-MAR-HPF1的半最大有效浓度（K_1/2）为0.48 nM，而对MAR-PARP1大于100 nM，显示超过200倍的动力学偏好。通过筛选ADP-核糖类似物，鉴定ADP-HPD为有效ARH3抑制剂，其半数抑制浓度（IC₅₀）为10.5 μM。ADP-HPD中的终末核糖″被羟吡咯烷部分替代，模拟O-糖苷键水解的环氧碳正离子样过渡态。结合ARH3活性位点结构分析和突变实验，研究人员提出Asp77作为广义碱激活催化水分子，对丝氨酸-ADP-核糖键的异头碳C1″进行亲核攻击的催化机制。该工作建立了Ser-MARylation逆转的机制框架，为合理设计ARH3抑制剂奠定基础。

**关键技术方法**
研究人员从大肠杆菌中表达纯化了人源PARP1、PARP2、HPF1、ARH3、ARH1、TARG1、MacroD1/D2、PARG等重组蛋白。通过PARP1/2与HPF1在含DNA和β-NAD⁺的反应体系中生成PARylated底物，再用PARG去除PAR链并保留蛋白近端MAR部分，制备Ser-MAR-HPF1和MAR-PARP1底物。使用eAf1521-Fc抗体（α-ADPR）进行Western blot检测ADP-核糖基化水平。采用链霉亲和素亲和pull-down验证底物完整性。动力学分析通过ARH3剂量反应和时间过程实验测定K_1/2。抑制剂筛选使用ADPR类似物（ADP-HPD、2′-脱氧-ADPR、8-Br-ADPR、ε-ADPR、ADPR-2′-PO₄、IDPR）进行ARH3抑制实验，并拟合四参数Hill方程计算IC₅₀。结构分析利用ARH3晶体结构（PDB ID: 6D36），鉴定活性位点中与Asp77和底物形成氢键的催化水分子。突变分析比较Glu41和Asp77系列突变体的水解活性。

**研究结果**
*重构MARylated PARP1和Ser-MARylated HPF1底物*：在PARP1:HPF1为1:1摩尔比、30分钟ADP-核糖基化和30分钟PARG消化条件下，可完全生成Ser-MAR-HPF1和MAR-PARP1底物。链霉亲和素pull-down证实两种MAR化蛋白均能与生物素化HPF1共纯化，说明底物完整性未受破坏。

*HPF1主要在丝氨酸上被ADP-核糖基化*：系统测试多种ADP-核糖基水解酶（ARH3、ARH1、TARG1、MacroD1/D2）对两种底物的活性，仅ARH3能有效去除Ser-MAR，其他酶无检测到活性。HPF1催化残基E284突变（E284A）导致HPF1 MARylation大幅降低，且残留修饰对ARH3具有抗性，表明修饰转向酸性残基。S26和S97虽为推测的KS基序丝氨酸，但S26A、S97A及双突变并未减少Ser-MARylation，反而增加，且仍完全被ARH3去除，说明HPF1的丝氨酸ADP-核糖基化分布在多个丝氨酸残基，不限于KS基序。

*ARH3优先高效水解Ser-MARylated HPF1*：剂量反应实验显示ARH3对Ser-MAR-HPF1的K_1/2为0.48 nM，对MAR-PARP1大于100 nM，偏好性超过200倍。时间过程实验表明在3.15 nM ARH3下，Ser-MAR-HPF1在10分钟内几乎完全水解，而MAR-PARP1在40分钟内仅适度减少。

*ADPR的终末核糖″对ARH3结合和抑制至关重要*：在ADPR类似物筛选中，仅ADP-HPD能有效抑制ARH3，使约80%的Ser-MARylation保留。ADPR本身及腺嘌呤碱基或腺苷核糖′2′-OH位修饰的类似物均不能抑制ARH3。ADP-HPD的终末核糖″被羟吡咯烷替代，模拟环氧碳正离子过渡态。定量测定ADP-HPD的IC₅₀为10.5 μM。

*ARH3逆转Ser-MARylation的催化机制*：在2.5 μM高浓度酶下，Glu41突变体（E41A、E41H、E41Q）保留与野生型相当的活性，而Asp77突变体（D77A、D77C、D77N）活性严重受损。这表明Glu41主要参与底物结合（通过Glu41-flap构象变化），而非催化步骤；Asp77是必需的催化残基。ARH3活性位点结构中，一个水分子与Asp77和ADPR底物同时形成氢键，位置适合对异头碳C1″进行亲核攻击。因此提出Asp77作为广义碱激活催化水，攻击丝氨酸-ADPR O-糖苷键的机制。

**讨论总结与结论**
该研究建立了Ser-MAR-HPF1作为研究ARH3介导Ser-MARylation逆转的稳健生化底物，解决了领域内缺乏明确蛋白质底物的核心难题。Ser-MAR-HPF1的丝氨酸特异性通过PARG对酪氨酸连接MAR的逆转、ARH3选择性水解以及E284A突变体抗性等多条证据确认。ARH3对Ser-MAR-HPF1和MAR-PARP1的200倍动力学差异可能源于PARP1自身修饰位点异质性和构象限制。ADP-HPD作为过渡态类似物抑制ARH3，确定了终末核糖″是ARH3有效结合和抑制的关键药效团，而腺苷部分修饰可耐受，为设计细胞渗透性前药（如乙酰氧甲基酯衍生物）提供了框架。由于ADP-HPD同时抑制PARG（PAR链降解）和ARH3（Ser-MAR水解），其细胞渗透衍生物可能产生双重抑制效应，导致PAR链和Ser-MAR化蛋白积累，可作为研究DNA损伤应答中Ser-ADP-核糖基化时空动态的化学探针。ARH3缺陷与PARP抑制剂耐药相关，选择性ARH3抑制剂可用于克服耐药或作为DNA修复缺陷肿瘤的联合治疗靶点。该工作为Ser-MARylation逆转提供了明确的机制框架，并为ARH3抑制剂开发奠定了基础。