芘并[4,5-d]咪唑/芘并[4,5-d]噁唑与苯并噻二唑的分子杂化物：用于生物传感与生物成像的可调控荧光团

《New Journal of Chemistry》：Molecular hybrids of pyreno[4,5-d]imidazole/pyreno[4,5-d]oxazole and benzothiadiazole as tunable fluorophores for biosensing and bioimagingOpen Access

　　

本文报道了一类新型有机荧光团的合成与表征，其结构将2,1,3-苯并噻二唑（BTD）与芘并[4,5-d]咪唑（PyIm）或芘并[4,5-d]噁唑（PyOz）整合于一体。这些化合物具有线性供体-受体（D–A）或供体-受体-受体（D–A–A）分子架构，从而形成扩展的π共轭骨架并增强分子内电荷转移（ICT）效应。研究人员通过单晶X射线衍射（SCXRD）分析表征了这些PyIm/PyOz–BTD杂化物的分子结构与固态堆积性质，紫外-可见吸收光谱与荧光光谱分析则揭示了强长波长吸收、高效荧光发射以及大斯托克斯位移。研究人员进一步证明，PyOz–BTD荧光团8在与牛血清白蛋白（BSA）结合后可作为荧光探针，表现出最大发射波长为480 nm的强发射。苯甲醛功能化的PyIm–BTD荧光团3表现出高效的跨膜行为，可被两种不同的细菌菌株——革兰氏阳性枯草芽孢杆菌（B. subtilis）与革兰氏阴性大肠杆菌（E. coli）—— readily内化，从而实现有效的荧光生物成像。

研究背景方面，有机荧光团已成为光电子学、化学传感、生物成像与安全技术等诸多领域不可或缺的工具。供体–π–受体（D–π–A）架构凭借其"推–拉"电子构型，在光激发下可促进高效的分子内电荷转移（ICT），从而实现荧光量子产率、斯托克斯位移与环境敏感性等关键光物理性质的精细调控。咪唑衍生物因其双电子性质（吡咯型氮富电子、吡啶型氮缺电子）而备受关注，将咪唑环稠合到多环芳烃（PAHs）中可带来增强的电子通信与电荷转移效率、抑制聚集导致猝灭（ACQ）以及提供配位位点等协同优势。2,1,3-苯并噻二唑（BTD）作为强π受体单元，可稳定LUMO、窄化前沿轨道能隙并诱导显著的红移，且具有高光稳定性、热稳定性与大斯托克斯位移等特性。尽管已有关于D–A–D型PyIm–BTD体系的研究报道，但具有D–A–A架构的非对称PyIm–BTD杂化物尚属空白。研究人员推测采用非对称D–A–A基元将强烈增强电子离域并放大ICT效应，从而诱导发射红移并产生大斯托克斯位移，这对于高效生物传感与生物成像至关重要。为此，研究人员设计并合成了化合物3作为目标荧光团，以阐明PyIm部分、BTD核心与额外羰基（C═O）电子受体基团之间的协同电子相互作用，并在合成过程中同时获得了两种类似荧光团（一种为中间体，另一种为意外副产物），从而为比较研究构效关系提供了条件。研究得出，三种荧光团在CH₂Cl₂中均表现出较高的荧光效率与显著的溶致荧光变色效应，其发射来自局部激发（LE）态与ICT态两种不同的激发态，相对贡献取决于溶剂性质；其中ICT发射带位于橙至红光谱区，高度契合生物传感与成像应用。噁唑基荧光团8对BSA表现出中等结合亲和力并在480 nm及以上波长产生明显荧光增强；PyIm–BTD荧光团3则表现出优于7和8的细菌成像性能，表明在PyIm–BTD骨架上附加极性基团（如醛基）可作为调控生物相容性的有效自下而上策略。该工作的重要意义在于引入了一类合成成本低、化学稳健且结构与光物理性质易于修饰的新型有机荧光团家族，拓展了用于蛋白质标记与细菌成像的有机荧光探针工具箱。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：通过缩合反应合成目标化合物3、7与8，并经真空过滤、乙醇洗涤及硅胶柱层析纯化；采用单晶X射线衍射（SCXRD）分析分子结构与固态堆积；利用紫外-可见吸收光谱与荧光光谱测定光物理性质，并结合含时密度泛函理论（TD-DFT）计算前沿分子轨道；通过Lippert–Mataga方程分析溶致荧光变色与ICT发射；采用荧光滴定实验结合非线性拟合测定8与BSA的解离常数（K_d）；运用AutoDock Vina（集成于YASARA软件包）进行分子对接分析；并以大肠杆菌（E. coli）与枯草芽孢杆菌（B. subtilis）为代表性菌株开展荧光显微镜细菌成像（具体培养方案见SI）。

研究结果方面，合成部分：化合物3通过芘-4,5-二酮（4）与BTD衍生物5在乙酸铵/冰乙酸条件下以1:2摩尔比于110 °C反应4 h制得，产率70%；尽管5含有两个反应性醛基，缩合仅限单一部分，归因于3的高极性与低溶解度导致其生成即沉淀而被有效隔离；合成5过程中观察到副产物6，其经类似反应除得到预期衍生物7（产率50%）外，还以31%产率获得副产物8，其结构以芘并[4,5-d]噁唑（PyOz）核心作为供体部分。单晶X射线衍射分析部分：化合物3的分子结构呈扭曲构象，PyIm、亚苯基与BTD单元间扭转角为24–30°，固态堆积采用滑移反平行基元，PyIm（供体）与BTD（受体）单元发生面对面π堆积；化合物7中PyIm与相邻亚苯基间扭转角为18.9°，亚苯基与BTD间为27.8°，固态堆积采用共面反平行排列，分子长度较短使堆积更紧密；化合物8中PyIm与亚苯基近乎共面（扭转角7.6°），而亚苯基与BTD间扭转角显著增大（45°），固态堆积采用人字形排列。紫外-可见与荧光性质部分：化合物3的低能吸收峰位于413 nm，TD-DFT计算表明其源于S₀ → S₁跃迁，主要贡献来自HOMO → LUMO与HOMO?1 → LUMO激发，HOMO定域于PyIm部分而HOMO?1与LUMO定域于BTD单元，导致HOMO与LUMO空间分离、直接跃迁基本禁阻，而HOMO?1与LUMO在BTD骨架上显著重叠产生允许跃迁；7与8的S₀ → S₁吸收带分别位于407 nm与392 nm，8的蓝移最大；3、7、8在CH₂Cl₂中的发射峰分别位于588、597与549 nm，荧光量子产率Φ_FL = 0.35–0.58，固态荧光行为得以保持，3与7的固态发射与溶液几乎一致，而8的固态发射红移17 nm。溶致荧光变色与ICT发射部分：化合物3表现出最显著的溶致荧光变色，发射峰从正己烷中的465 nm移至丙酮中的635 nm，在365 nm紫外光下呈现从深蓝到深红的变化；3在EtOAc与丙酮中呈现双发射带；Lippert–Mataga分析显示二氧六环、甲苯、EtOAc、CH₂Cl₂与丙酮五种溶剂呈良好线性相关且斜率陡峭，表明发射强烈依赖溶剂极性，与发射性ICT态一致，而其余溶剂数据分散，表明发射源于极性较小的LE态；低于500 nm的短波长带源于PyIm单元的LE态，高于570 nm的长波长带源于激发后由LE态布居的发射性ICT态；7与8同样表现溶致荧光变色并呈现两种相关区域。BSA荧光标记部分：荧光滴定实验表明仅化合物8在BSA存在下产生荧光增强，非线性拟合给出解离常数K_d = 5.77 ± 0.91 μM（R² = 0.984），表明中等结合亲和力；分子对接显示三种荧光团对BSA的结合能相似（3–BSA为11.48 kcal mol^?1，7–BSA为11.28 kcal mol^?1，8–BSA为11.34 kcal mol^?1），3结合于BSA的IB亚域，7与8结合于IIIA亚域附近，7的咪唑单元与8的噁唑单元均与Leu-189形成类似氢键相互作用；研究人员提出8的选择性荧光增强并非源于优先结合，而是归因于噁唑单元缺乏氢键供体能力，避免了以咪唑基N–H为质子供体的质子耦合电子转移（PCET）所致猝灭。细菌荧光成像部分：以E. coli与B. subtilis为革兰氏阴性与阳性菌代表，仅荧光团3实现对两种细菌的有效成像，7与8仅产生微弱荧光信号；对E. coli，3在475 nm激发下提供更佳的信噪对比，而对B. subtilis则以385 nm激发成像更优；3的优异成像性能归因于BTD部分连接的苯甲醛基团，其可能通过与细菌细胞壁的有利极性相互作用促进内化。

讨论与结论部分：该工作总结了三种基于PyIm或PyOz核心与BTD基团结合的结构类似有机荧光团的合成与表征。SCXRD分析揭示了不同的分子构象与固态堆积排列，进而影响其溶液与固态光物理性质。三种荧光团在CH₂Cl₂中具有较高荧光效率并在多种有机溶剂中表现显著溶致荧光变色效应，适用于多种荧光应用。Lippert–Mataga分析表明发射来自LE态与ICT态两种不同的激发态，其相对贡献取决于溶剂性质，ICT发射带最大位于橙至红光谱区，与生物传感和成像应用高度兼容。三种探针中，噁唑基荧光团8不仅对BSA显示中等结合亲和力，还在480 nm及以上波长产生明显荧光增强，凸显其在剖析与追踪涉及BSA的生物事件方面的潜力。此外，PyIm–BTD荧光团3的细菌成像性能优于7与8，表明在PyIm–BTD骨架上附加额外极性基团（如醛基）可作为调控生物相容性的有效自下而上策略。总之，该工作引入了一类合成成本低、化学稳健且结构与光物理性质易于修饰的新型有机荧光团家族，拓展了用于蛋白质标记与细菌成像的有机荧光探针现有工具箱。