生物正交膜锚定金双锥纳米颗粒用于近红外光热神经元抑制

《Advanced Science》：Membrane-Targeted Nanoparticles for Neuronal Photomodulation

　　

将纳米颗粒选择性靶向至神经元界面，是针对性发展精准神经技术的核心。研究人员报道了一种生物正交策略，将金双锥纳米颗粒（gold bipyramids, AuBPs）作为模型纳米材料锚定于原代神经元（primary neurons）膜表面。该过程分为两步：连接分子先与神经元受体结合并暴露反式环辛烯（trans-cyclooctene, TCO）基团，随后该基团与纳米颗粒表面的四嗪（tetrazine, Tz）官能团形成共价键，使每个细胞可保留数百个纳米颗粒。在同步化细胞培养体系中，利用生物正交策略以等离激元纳米颗粒（plasmonic nanoparticles）选择性标记神经元膜，可在近红外（near-infrared, NIR）激光照射下通过光热效应抑制神经元活动。单独使用连接分子和/或纳米颗粒对神经调控的影响可忽略。纳米颗粒在膜上的保留过程迅速，总孵育时间仅需1 h，且未观察到细胞毒性作用。上述结果拓展了可用于非侵入性神经调控的光激活纳米材料体系。

**研究背景与目的**

传统红外神经刺激主要依赖脉冲激光直接加热水，存在辐射暴露较高、受皮肤和组织安全阈值限制以及空间分辨率有限等问题。等离激元纳米颗粒可通过局域表面等离激元共振（localized surface plasmon resonance, LSPR）将入射光转化为局部热量，从而以较低入射功率密度将光能集中至纳米尺度；但其有效光热作用依赖激发波长与LSPR匹配，因此需要对纳米颗粒的形貌和尺寸进行精确设计。神经调控本质上是膜相关过程，纳米颗粒只有在神经元膜上获得充分保留，才能更有效地将电磁辐射转化为局部热效应，并进一步引起生理响应。然而，纳米颗粒通过分子识别实现膜固定时，常受到蛋白冠等因素干扰。基于点击化学（click chemistry）的生物正交膜修饰被认为具有较高特异性，但此前方法能否推广至有机染料以外的材料仍缺乏验证。基于此，研究人员以金双锥纳米颗粒为模型，将AMPAR选择性拮抗剂PFQX连接分子与TCO-Tz生物正交反应结合，建立了神经元膜靶向纳米颗粒体系，并评估其用于无线光热神经调控的可行性。该研究发表于《Advanced Science》。

**关键技术方法**

研究采用SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞及大鼠原代皮层（cortex, CTX）神经元。关键技术包括：金双锥纳米颗粒制备及Tz/Zw双配体表面功能化；TCO-Tz生物正交膜锚定；共聚焦荧光显微成像、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）和电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS）评价纳米颗粒分布与细胞结合量；多电极阵列（multielectrode array, MEA）记录神经电活动；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）和神经丝轻链（neurofilament light chain, NfL）释放检测评价安全性。

**2.1 纳米颗粒与表面化学**

研究人员选择具有尖锐尖端和近红外LSPR的金双锥纳米颗粒作为模型材料。其LSPR线宽较窄、吸收截面较大，有利于提高光热转换效率；同时，其五重孪晶结构较单晶金纳米棒具有更高的热稳定性。所制备AuBPs长度约为82 ± 2 nm、宽度约为26 ± 1 nm，LSPR中心约为785 nm。为构建稳定的表面化学结构，研究人员先将十六烷基三甲基氯化铵（cetyltrimethylammonium chloride, CTAC）替换为柠檬酸盐，再连接含Tz的HS-PEG-Tz和含两性离子端基的HS-PEG-Zw。LSPR红移6 nm提示聚合物配体交换成功；两性离子配体可抑制纳米颗粒在生理培养基中聚集，使AuBP@Tz/Zw至少24 h保持胶体稳定。进一步通过TCO-Aurora Fluor 568染料及球形纳米颗粒连接实验，证实Tz功能化AuBPs在复杂生理介质中仍具有化学反应活性和可及性。

**2.2 金双锥纳米颗粒在神经元界面的靶向**

在SH-SY5Y细胞中，连接分子预处理后加入AuBPs，共聚焦成像显示连接分子依赖性荧光；0.5至3 h时定量差异不显著，24 h时连接分子组的AuBP/细胞核荧光比值增加约两倍。为克服共聚焦显微镜分辨率的限制，研究人员在大鼠原代CTX神经元中联合使用TEM、ICP-MS和毒性检测。TEM显示，0.5 h时未使用连接分子的样品中未观察到AuBPs，而连接分子预处理可使纳米颗粒装饰于细胞膜；此时连接分子组检测到28个纳米颗粒，其中100%位于细胞膜，对照组检测到16个。ICP-MS显示连接分子预处理使金含量增加1.5倍。根据单个金双锥质量与测得金总量，研究人员估计0.5 h时平均每个细胞结合约650个纳米颗粒。24 h时，膜相关纳米颗粒数量与0.5 h相近，但仅占全部颗粒的14%，其余86%进入内溶酶体；无连接分子时，检测到的纳米颗粒均聚集于细胞质。LDH、NfL及形态学结果均未显示明显的膜损伤或神经元损伤，表明该两步锚定策略具有良好细胞相容性。

**2.3 光热调控**

研究人员将成熟CTX神经元培养于16电极MEA，并耦合785 nm连续波激光进行光热刺激。暗条件下将温度由31 °C升至41 °C可使平均放电率（mean firing rate, MFR）逐渐降低，尖峰幅度约下降10%，冷却后活动可恢复，说明单纯升温可逆地抑制网络兴奋性。激光照射时，只有同时使用连接分子和AuBPs的神经元出现MFR降低；在100 ms脉冲下，5、16和26 W/cm²分别使MFR下降约15%、30%和45%，而单独使用连接分子或纳米颗粒均无明显影响。降低AuBPs浓度后，5 W/cm²下不同脉宽均引起约10%的抑制，而26 W/cm²下抑制作用随脉宽延长而增强。尖峰幅度约降低10%，但爆发率未随功率密度持续下降，提示光热作用降低单个神经元放电活动，同时未破坏网络同步连接。MFR对单脉冲能量剂量的斜率受纳米颗粒浓度影响；据此估计，在0.002 nM条件下，约130个/细胞的膜结合纳米颗粒可能是实现有效光热调控的近似下限。LDH释放、NfL释放、神经突起完整性及刺激后恢复记录均未显示明显光热损伤或持续性活动抑制。

**讨论与结论**

讨论指出，观察到的MFR和尖峰幅度下降与可逆的温度依赖性神经元活动抑制一致，但现有细胞外记录不能确定具体分子机制。局部热效应可能影响Na⁺/K⁺ ATP酶活性、电压门控钠通道失活动力学、膜电阻或膜电容，但这些均属于基于既有生物物理证据的可能解释，尚不能由本研究直接区分。该策略的主要意义在于同时控制神经元界面光活性纳米颗粒的数量及膜/细胞质空间分布，从而缩小光热神经调控复杂参数空间。该方法具有材料通用性，连接分子还可针对其他离子通道或神经递质受体进行定制；但内化AuBPs的长期细胞内转归仍未明确。

研究结论认为，研究人员利用具有双配体表面化学特征的金双锥纳米颗粒及AMPAR靶向连接分子，通过生物正交两步法将数百个纳米颗粒保留于神经元界面，总孵育时间仅需1 h。在近红外激光和中等单脉冲能量剂量（13 J/cm²）条件下，该体系降低MFR并改变细胞外尖峰波形，其表现与可逆性本体加热一致。该研究提供了一种可精确调节纳米颗粒数量及空间分布的光热神经调控方法，并为后续解析受体触发通路与膜电容通路等生理机制、拓展其他纳米材料及受体靶向策略提供了实验基础。