《Advanced Science》：Early-Life Polyethylene Microplastic Exposure Exacerbates ADHD-Like Behaviors in Mice via PI3K/AKT1/Nrf2 Signaling: Evidence From the Pilot Cohort and Multi-Omics Analyses
微塑料污染可能影响神经发育，但其与注意缺陷多动障碍（ADHD）的关系尚不清楚。研究人员整合了儿童队列、多组学分析、网络毒理学和动物实验，以探究聚乙烯（PE）微塑料暴露与ADHD易感性之间的关系。在90名儿童中，PE是血液中检测到的主要聚合物，且在ADHD患儿中更为丰富。较高的PE负荷与更严重的症状、升高的白细胞介素-6（IL-6）水平以及降低的抗氧化能力相关。多组学和网络分析共同指向PI3K/AKT1/Nrf2信号通路。在围产期尼古丁暴露小鼠模型中，发育期PE共暴露加剧了ADHD样行为、多巴胺能功能障碍和氧化损伤。褪黑素通过恢复PI3K/AKT1/GSK3β和Nrf2信号通路部分缓解了这些异常，而AAV介导的PI3K敲低削弱了其保护作用。总体而言，人体研究结果确定了循环PE负荷作为ADHD相关神经发育脆弱性的环境相关因素，而动物实验提供了证据表明发育期PE共暴露可在易感背景下加重ADHD样异常。
**研究背景**
微塑料（microplastics）通常指直径小于5 mm的塑料碎片，已成为广泛存在的环境污染物，在食品、饮用水、大气及生物圈中均有检出。人体可通过摄入、吸入及潜在皮肤接触等途径暴露，且已在人体血液、胎盘及脑组织中被定量检测到。儿童因生理屏障发育不完善、抗氧化防御系统未成熟、手口行为频繁以及相对体重暴露量更高等因素，可能尤为脆弱。实验研究表明，微米级和纳米级塑料颗粒能够穿越胃肠上皮屏障进入血液循环并沉积于神经组织，引发氧化还原失衡、胶质细胞激活及行为异常。然而，直接将体内微塑料负荷与儿童神经发育障碍联系起来的证据极为匮乏，尤其是早期微塑料暴露对ADHD易感性或临床表现的潜在影响几乎未得到研究。
ADHD是一种常见的神经发育障碍，以持续注意力困难、过度活动和冲动控制减弱为核心特征，严重影响学业、人际关系和整体健康。荟萃分析估计全球约8%的儿童和青少年受ADHD影响。尽管ADHD具有高度遗传性，但双生子和流行病学研究共同指向基因-环境交互模型，其中早期环境不良因素（尤其是妊娠期和围产期）调节疾病风险和症状严重程度。已确认的环境因素包括母亲吸烟、产前尼古丁暴露和早期有毒物质负荷，但新兴环境污染物（尤其是早期微塑料暴露）的作用仍知之甚少。氧化应激和炎症反应是微塑料毒性与ADHD病理生理学之间的关键机制汇聚点。前额叶皮层儿茶酚胺信号功能障碍被广泛认为是ADHD的核心神经生物学特征，多巴胺和去甲肾上腺素调节注意力、行为抑制、工作记忆、动机和执行功能。氧化应激和炎症可进一步损害儿茶酚胺合成、受体信号、突触可塑性和神经元存活。微塑料不仅可通过直接组织沉积影响神经系统，还可通过外周炎症和氧化应激发挥作用。纳米塑料暴露已被证明可改变培养皮层神经元中多巴胺受体的表达，提示塑料颗粒可能干扰与神经发育状况相关的多巴胺能信号。因此，研究人员假设早期微塑料暴露诱导氧化应激和炎症，进而破坏多巴胺稳态并加剧ADHD样行为。
**研究概况**
在此背景下，研究人员整合了一个初步儿科队列、多组学分析、计算方法和机制性动物实验，以探究循环微塑料负荷与ADHD之间的关系。研究结果表明，PE负荷与升高的炎症和氧化应激标志物呈正相关，而这些标志物又与ADHD症状严重程度相关。通过计算筛选，研究人员鉴定了能够恢复PI3K/AKT1/Nrf2信号的化合物，作为机制验证物和候选干预策略。具体而言，研究人员发现褪黑素（melatonin）给药可增强PI3K/AKT/Nrf2信号及下游抗氧化防御，从而部分减轻与PE共暴露相关的行为、分子和代谢异常。此外，AAV介导的前额叶皮层PI3K敲低显著削弱了褪黑素的保护作用，支持PI3K/AKT1/Nrf2信号作为其神经保护作用的关键机制介质。该论文发表在《Advanced Science》。
**关键技术方法**
研究人员采用的主要技术方法包括：（1）在江南大学附属医院儿科开展初步横断面观察性队列研究，连续纳入45名新诊断ADHD患儿和45名年龄、性别匹配的健康对照儿童，采集外周血进行微塑料检测、炎症和氧化应激指标测定、靶向生化检测、代谢组学分析和转录组学分析；（2）采用显微拉曼光谱（micro-Raman spectroscopy）检测和鉴定血液中的微塑料聚合物类型，并实施全面的质量保证与质量控制程序；（3）对严重ADHD患儿和健康对照进行非靶向代谢组学分析和外周血RNA测序及转录组学分析；（4）利用网络毒理学、孟德尔随机化（Mendelian randomization, MR）分析和分子对接及分子动力学模拟进行计算筛选；（5）建立围产期尼古丁暴露（perinatal nicotine exposure, PNE）ADHD样小鼠模型，进行PE微塑料和褪黑素干预，并开展系列行为学测试（三箱社交互动实验、旷场实验、大理石掩埋实验、新物体识别实验、Morris水迷宫和五选择序列反应时间任务（5-CSRTT））；（6）采用AAV介导的PIK3CA敲低进行功能验证，以及细胞热位移分析（CETSA）评估PIK3CA热稳定性。
**研究结果**
**3.1 增加的PE负荷与ADHD症状严重程度、炎症和抗氧化能力受损相关**
研究人员建立了包含45名ADHD患儿和45名健康对照的初步观察队列，采用显微拉曼光谱鉴定循环微塑料。拉曼光谱确认血液样本中存在PE、聚丙烯（PP）和聚苯乙烯（PS）颗粒，另外还检测到聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚氯乙烯（PVC）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚氨酯（PU）和聚己二酸-对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）等其他聚合物类型。所有主要聚合物类型的检出率在ADHD患儿中均数值上高于对照组。PET在外周血中检出率最高（对照组82.2%，ADHD组95.6%）；然而，相对聚合物组成分析显示PE是ADHD患儿中最丰富的聚合物，占总微塑料丰度的36.7%，而对照组为27.2%。PE的相对丰度和血液PE浓度在ADHD组均显著高于对照组（p < 0.05），而平均PE颗粒大小在两组间无差异（1.72 μm vs. 1.96 μm；最大值接近5 μm）。因此研究人员聚焦于PE，检查PE负荷与ADHD症状严重程度之间的关联。
研究人员接着测量了循环细胞因子和氧化还原相关生物标志物。ADHD患儿血液IL-6水平显著升高（p < 0.01），而IL-1β和TNF-α水平在两组间无差异。ADHD患儿还表现出丙二醛（MDA）升高和谷胱甘肽（GSH）降低（p < 0.05），超氧化物歧化酶（SOD）活性数值上较低但未达统计学显著性。根据临床医生实施的DSM-5严重程度分级，ADHD患儿被分为轻度、中度和重度亚组；SNAP-IV和Conners-3评分用于定量表征症状负担。PE在总循环微塑料负担中的相对贡献随症状严重程度增加，在轻度、中度和重度亚组中分别占检测到聚合物的约28.2%、36.0%和44.6%。一致地，血液PE浓度在中度亚组显著高于轻度亚组，在重度ADHD患儿中最高（p < 0.01）。Spearman相关分析表明血液PE浓度与SNAP-IV评分（R = 0.58, p < 0.001）和Conners T评分（R = 0.56, p < 0.001）均呈正相关，表明较高的PE负荷与更严重的ADHD症状相关。
亚组分析进一步显示，重度ADHD患儿循环IL-6水平显著高于轻度亚组，但与中度亚组无显著差异（p < 0.01）。MDA水平在严重程度亚组间呈轻微上升趋势但未达显著性，而GSH水平逐渐下降，中度和重度亚组显著低于轻度亚组（p < 0.01）。血液PE浓度与IL-6水平呈正相关（R = 0.61, p < 0.001），与GSH水平呈负相关（R = ?0.67, p < 0.001），而与MDA的关联未达统计学显著性（R = 0.3, p = 0.085）。IL-1β、TNF-α和SOD在ADHD严重程度亚组间无显著差异。总体而言，这些发现表明增加的PE负荷与ADHD症状严重程度、炎症和抗氧化能力受损相关。
**3.2 多组学分析提示PI3K/AKT1/Nrf2信号通路参与PE负荷与ADHD相关表型之间的关联**
为探究可能连接PE暴露与ADHD相关表型的代谢通路，研究人员对年龄和性别匹配的重度ADHD患儿和健康对照进行了外周血非靶向代谢组学分析。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示两组间清晰分离，差异分析鉴定出重度ADHD患儿中126种增加和115种减少的代谢物。在前20条富集的KEGG通路中，甘油磷脂代谢和谷胱甘肽代谢与观察到的氧化应激和脂质稳态异常特别相关。研究人员接着在轻度、中度和重度亚组中定量了循环多不饱和脂肪酸和脂质过氧化产物。二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）水平随严重程度增加而逐渐降低，而花生四烯酸（AA）基本不变；因此，AA/DHA和AA/EPA比值从轻度到重度ADHD逐渐升高。同时，循环磷脂酰胆碱氢过氧化物和8-异前列腺素F2α水平随症状严重程度增加，在重度ADHD患儿中达到峰值。这些发现表明ADHD严重程度增加伴随甘油磷脂稳态破坏和脂质过氧化增强，可能进一步放大氧化应激和炎症。
为鉴定连接PE暴露与ADHD的分子靶点，研究人员将GeneCards中的ADHD相关基因与比较毒理基因组学数据库（CTD）中的PE相关基因取交集，获得32个共享候选基因。蛋白质-蛋白质相互作用分析显示这些靶点间存在广泛连接，其中AKT1、IL6、PIK3CA和NFE2L2占据网络中心位置。Reactome富集分析涉及白细胞介素信号、NFE2L2介导的核事件和CD28依赖的PI3K/AKT信号。最大团中心性（MCC）、边渗滤分量（EPC）和度（degree）算法联合鉴定出14个枢纽基因。随后进行孟德尔随机化分析以评估14个枢纽基因的遗传预测表达与ADHD风险之间的关联。在评估的基因中，遗传预测的AKT1表达与ADHD风险呈最强的名义负相关（P < 0.05）；然而，该关联在多检验校正后未保持统计学显著性（FDR > 0.05）。关联方向在敏感性估计器中大体一致。这些发现将AKT1优先列为PE相关分子网络中与ADHD易感性相关的候选基因。
为进一步探究PI3K/AKT1/Nrf2信号的参与，研究人员对年龄和性别匹配的重度ADHD患儿和健康对照进行了外周血转录组学分析。主成分分析（PCA）显示全局基因表达谱的组依赖性偏移。经Benjamini-Hochberg校正后，339个基因满足预定义的差异表达标准（BH校正p < 0.05且|log2FC| ≥ 0.58），包括重度ADHD患儿中201个上调和138个下调基因。GO富集分析突出白细胞活化和磷脂酰肌醇磷酸化调控，KEGG分析鉴定出细胞因子-细胞因子受体相互作用和PI3K-Akt信号等显著富集通路。GSEA进一步证明重度ADHD中IL-6产生相关基因集的富集（NES = 2.19, FDR = 0.004）。预定义PI3K/AKT1/Nrf2通路相关基因的表达分析显示重度ADHD中PIK3CA、PIK3R1、AKT1、NFE2L2和GCLC表达降低。RT-qPCR分析进一步显示这些基因的降低在重度亚组中最为明显。免疫细胞富集分析还揭示了CD8 T细胞、调节性T细胞、γδ T细胞以及静息和活化肥大细胞特征的改变，支持外周免疫失调。为在独立数据集中进一步评估更广泛转录组改变的稳健性，研究人员还分析了公开的全血数据集GSE159104（包含39名ADHD患儿和37名健康对照），鉴定出161个DEGs，功能富集分析突出过氧化物酶体相关术语以及核糖体和蛋白质稳态功能相关通路。总体而言，代谢组学、网络、遗传、转录组和免疫谱分析结果共同指向PI3K/AKT1/Nrf2信号作为连接PE暴露与脂质过氧化、氧化应激、外周炎症和ADHD症状严重程度的候选分子通路。
**3.3 计算机筛选鉴定褪黑素为PE暴露诱导神经毒性的候选保护性调节剂**
研究人员通过Enrichr网络服务器使用药物特征数据库（DSigDB）对PE暴露和ADHD相关靶点之间的32个共享基因进行候选生物活性化合物筛选。聚焦于有充分文献记载的抗氧化化合物，研究人员选择了N-乙酰-L-半胱氨酸、白藜芦醇、褪黑素、谷胱甘肽和姜黄素作为与靶点集相关的五个排名最高的候选物。随后在暴露于5 mM谷氨酸的HT22海马神经元细胞中评估其保护活性。浓度-反应分析得出EC50值分别约为：N-乙酰-L-半胱氨酸3.12 mM、白藜芦醇26.41 μM、褪黑素12.27 μM、谷胱甘肽3.42 mM和姜黄素32.15 μM。褪黑素在五个候选物中显示最低的EC50，因此被选用于进一步机制研究。
分子对接预测褪黑素占据PIK3CA和AKT1两者的结合口袋，结合亲和力分别为?7.8 kcal/mol（褪黑素-PIK3CA）和?6.8 kcal/mol（褪黑素-AKT1）。2D相互作用图揭示了褪黑素与预测结合位点周围残基之间的多个氢键、疏水和范德华相互作用。两个复合物的稳定性通过100 ns分子动力学模拟进一步评估。PIK3CA-褪黑素复合物显示初始构象调整后稳定的RMSD轨迹，RMSF分析仅识别局部柔性区域，大多数残基保持低波动。回转半径和溶剂可及表面积保持在受限范围内，表明整体紧凑性保持。分子间氢键间歇性保留，自由能景观揭示了不同的低能构象盆地。AKT1-褪黑素复合物显示相当的稳定特征。这些计算发现支持褪黑素与PIK3CA和AKT1两者的稳定相互作用。基于这些分析，研究人员假设褪黑素通过调节PI3K/AKT1/Nrf2信号减轻PE暴露诱导的ADHD神经毒性。
**3.4 早期PE暴露加剧围产期尼古丁暴露诱导的小鼠ADHD样行为**
早期生命是ADHD病理生理学中环境不良因素脆弱性的关键窗口，但早期PE暴露是否加剧ADHD相关表型仍研究不足。研究人员首先检查PE单独暴露是否足以诱导可测量的行为异常。在三箱社交互动实验中，对照组、低PE（1 mg/kg）和高PE（3 mg/kg）组在总移动距离、社交偏好或社交新奇偏好方面均无显著差异。一致地，PE单独暴露未显著改变5-CSRTT表现。在逐渐缩短的刺激持续时间中，反应准确性和遗漏率在三组间相当，在延长的试验间期中未观察到过早或持续性反应的显著差异。这些阴性对照发现表明，在本暴露条件下，早期PE单独暴露不足以产生社交行为、注意力表现或冲动控制的明显异常，支持"二次打击"模型，即PE暴露加剧预先存在的神经发育脆弱性而非独立产生ADHD样表型。因此研究人员使用围产期尼古丁暴露（PNE）ADHD样行为模型在易感背景中研究早期PE暴露的影响。简言之，怀孕C57BL/6J小鼠从胚胎第1.5天至出生后第21天（PND 21）在饮用水中接受尼古丁（100 μg/mL），PE微塑料和褪黑素在同一时期通过口服灌胃给予母鼠，使子代从E1.5至P21通过母体给药暴露。扫描电子显微镜显示实验所用PE颗粒具有不规则形态，代表性大小约5 μm。尼古丁暴露子代出生体重显著低于对照组。从PND 0到PND 21的生长曲线揭示各组间生长轨迹改变：尼古丁暴露子代最初显示追赶性生长并逐渐恢复至正常体重，而PE暴露子代随后表现出显著高于对照组的体重，此效应可能与PE诱导的脂质代谢紊乱有关并被褪黑素部分减弱。
行为学表征进一步使用三箱社交互动实验、旷场实验、大理石掩埋实验、新物体识别（NOR）实验、Morris水迷宫（MWM）和五选择序列反应时间任务（5-CSRTT）进行。在三箱实验中，第0阶段各组总移动距离或穿梭次数无显著差异，表明各组运动活性和自发探索相当（p > 0.05）。在社交阶段，对照小鼠探索陌生人1的时间显著多于空笼，而此偏好在ADHD样小鼠中降低并被PE共暴露进一步损害。ADHD + 高PE组对社会刺激无明确偏好，而褪黑素部分恢复社交探索。一致地，社交偏好指数在ADHD、ADHD + 低PE和ADHD + 高PE组中逐渐降低，并被褪黑素显著改善。在社交新奇阶段，对照小鼠优先探索新陌生人2而非熟悉陌生人1。此偏好在ADHD样小鼠中减弱并被PE共暴露进一步降低，在ADHD + 高PE组中观察到最明显的损害。褪黑素部分恢复对新小鼠的偏好。社交新奇偏好指数显示PE暴露后相应梯度下降并被褪黑素治疗部分恢复。这些发现表明早期PE暴露加剧PNE诱导的ADHD样小鼠的社交行为异常。为更直接评估与ADHD核心特征相关的行为域，研究人员进一步使用5-CSRTT评估注意力表现和冲动行为。在逐渐缩短的刺激持续时间（0.8、0.6、0.4和0.2 s）中，ADHD样小鼠与对照组相比表现出反应准确性降低和遗漏率增加，表明注意力表现受损。PE共暴露以剂量依赖方式进一步加剧这些异常，在ADHD + 高PE组中观察到准确性最大降低和遗漏最大增加。褪黑素部分恢复准确性并降低遗漏率。随后通过将试验间期从5 s逐渐延长至11 s评估冲动行为。ADHD样小鼠与对照组相比表现出增加的过早反应，PE共暴露进一步增加过早反应，特别是在较长试验间期，而褪黑素部分减弱此效应。持续性反应反映反应控制受损和重复反应，显示类似的暴露依赖性增加并被褪黑素部分降低。总体而言，5-CSRTT结果提供直接行为证据表明早期PE暴露加剧PNE诱导的ADHD样模型中的注意力缺陷和冲动反应，从而将行为表型扩展到其他行为范式鉴定的社交、焦虑相关、重复和认知异常之外。
在旷场实验中，代表性热图显示ADHD样和PE暴露小鼠中央区域探索逐渐减少，而平均运动速度在各组间无差异，排除运动功能偏倚。中央区进入次数和中央区停留时间在ADHD样小鼠中减少，PE暴露进一步降低，褪黑素在高剂量PE组中显著增加（p < 0.05），表明焦虑样行为加剧。类似地，在大理石掩埋实验中，ADHD样小鼠比对照掩埋更多大理石；PE暴露以剂量依赖方式进一步增加大理石掩埋，褪黑素减少高剂量PE组的掩埋大理石数量，表明重复、强迫样行为加剧及其被褪黑素减弱。在新物体识别实验中，各组间奔跑速度相当（P > 0.05）。对照小鼠探索新物体的时间显著多于熟悉物体；此偏好在ADHD样小鼠中降低，在低剂量和高剂量PE组中缺失，褪黑素恢复高剂量PE暴露小鼠对新物体的优先探索。辨别指数在尼古丁和PE暴露后逐渐下降，在高剂量PE组变为负值，并被褪黑素部分恢复（p < 0.05）。在Morris水迷宫中，各组间游泳速度无差异，排除运动功能偏倚。在五天获取阶段，所有组随时间显示逃逸潜伏期减少；然而ADHD样小鼠学习慢于对照，PE暴露进一步延长逃逸潜伏期，特别是从第三天训练起（P < 0.05）。在探针试验中，ADHD样小鼠显示较少的平台穿越次数和较短的目标象限停留时间；这些损害被PE暴露剂量依赖性加剧并被褪黑素部分逆转。代表性游泳轨迹证实了定量发现，高剂量PE暴露小鼠显示较不集中的搜索模式，褪黑素治疗小鼠显示目标导向搜索的部分恢复。总体而言，这些发现表明早期PE暴露加剧ADHD相关的注意力和冲动控制缺陷，以及更广泛的社交行为、焦虑相关行为、重复反应和认知功能异常，而褪黑素提供部分行为保护。
**3.5 早期PE暴露加剧ADHD样小鼠神经元损伤、扰乱脂质稳态并增强炎症和氧化应激反应**
为无偏倚地描绘早期PE暴露影响的分子通路，研究人员对ADHD和ADHD + 低PE小鼠的前额叶皮层（PFC）组织进行了RNA测序。主成分分析显示两组间清晰分离，表明PE暴露实质性改变了前额叶皮层转录组。差异表达分析鉴定出321个差异表达基因，包括上调和下调转录本。GO富集分析表明PE暴露影响多巴胺受体信号和多巴胺代谢过程，KEGG分析进一步涉及酪氨酸代谢、细胞因子-细胞因子受体相互作用和PI3K/AKT信号。基因集富集分析显示与ADHD组相比，ADHD + 低PE组中谷胱甘肽代谢显著抑制，而甘油磷脂代谢正富集。这些结果与儿科队列中检测到的氧化还原和磷脂异常一致。RT-qPCR分析进一步显示NFE2L2及其下游抗氧化基因（包括GCLC、NQO1和HO-1）在ADHD样小鼠PFC中显著降低。PE暴露对这些基因产生额外的剂量依赖性降低，而褪黑素部分恢复高剂量PE暴露小鼠中的表达。这些发现表明PE暴露抑制Nrf2依赖的抗氧化转录程序，与观察到的谷胱甘肽代谢抑制一致。
Nissl染色显示尼古丁和PE暴露后海马CA3和CA1区域进行性神经元紊乱和丢失。定量证实ADHD样小鼠显著神经元丢失，PE暴露组减少更大，高剂量PE组丢失最明显，褪黑素部分保护。海马脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白表达在ADHD样小鼠中降低，PE暴露进一步降低，褪黑素在高剂量PE组显著恢复（P < 0.05）。血清EPA和DHA水平被尼古丁暴露降低并在PE给药后进一步下降（P < 0.05），而循环AA、AA/EPA和AA/DHA比值以及磷脂酰胆碱氢过氧化物和8-异前列腺素F2α水平在尼古丁和PE暴露后逐渐升高（P < 0.05）。褪黑素部分纠正这些代谢异常。在PFC中，IL-1β和TNF-α以及IL-6和MDA水平在ADHD样小鼠中升高并在PE暴露后进一步增加，而SOD和GSH水平显示相反模式，在PE处理组中逐渐降低。褪黑素降低IL-6和MDA水平同时恢复高剂量PE暴露小鼠的SOD和GSH水平（P < 0.05）。总之，这些发现表明早期PE暴露加剧ADHD样小鼠的神经元损伤、扰乱脂质稳态并增强炎症和氧化应激反应。
**3.6 PE暴露抑制ADHD样小鼠PI3K/AKT1/Nrf2信号和抗氧化防御，褪黑素重新激活该轴**
研究人员首先检查PE暴露是否改变PFC中多巴胺代谢。多巴胺和去甲肾上腺素水平在ADHD样小鼠中显著降低并在PE暴露后剂量依赖性进一步下降（p < 0.05），褪黑素部分恢复高剂量PE暴露小鼠中的两种神经递质。相比之下，3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）水平在各组间基本不变（p > 0.05）。因此，DOPAC/DA比值在尼古丁暴露后升高并在PE给药后进一步升高，表明相对于减少的多巴胺池多巴胺周转加速，褪黑素显著降低升高的比值（p < 0.05）。Western blot分析进一步显示酪氨酸羟化酶（TH）和多巴胺D1受体（DRD1）蛋白水平在ADHD样小鼠中降低，PE暴露进一步抑制，高剂量组降低最明显，褪黑素部分恢复。这些发现表明PE暴露加剧ADHD样小鼠前额叶多巴胺能功能障碍，而褪黑素部分保持多巴胺合成和受体信号。
研究人员接着探究褪黑素的保护作用是否与PI3K催化亚基p110α（PIK3CA）的结合相关。使用PIK3CA/p110α特异性抗体进行CETSA。在高剂量PE暴露的ADHD样小鼠PFC裂解物中，可溶性PIK3CA组分随温度从45°C升高至65°C而逐渐减少。褪黑素处理小鼠的样本在55°C、60°C和65°C保留显著更高水平的可溶性PIK3CA（p < 0.05），而在45°C或50°C未观察到显著差异。这些发现表明褪黑素给药后PIK3CA热稳定性增加，与p110α催化亚基的细胞结合一致。结合分子对接和分子动力学结果，CETSA发现支持PIK3CA作为与褪黑素介导的PI3K/AKT1信号激活相关的候选分子靶点。Western blot分析进一步显示PI3K p85调节亚基Tyr458、AKT1 Ser473和GSK3β Ser9的磷酸化在ADHD样小鼠PFC中降低并被PE暴露剂量依赖性进一步抑制（p < 0.05），而总PI3K p85、AKT1和GSK3β蛋白丰度基本不变。褪黑素显著恢复高剂量PE暴露小鼠中所有三种信号蛋白的磷酸化。由于GSK3β Ser9磷酸化抑制其激酶活性，AKT1依赖性GSK3β磷酸化的恢复与减少GSK3β介导的Nrf2信号抑制一致。与此解释一致，Keap1蛋白丰度在尼古丁暴露后增加并在PE共暴露后进一步升高，而Nrf2表达逐渐降低（p < 0.05）。褪黑素降低Keap1丰度同时部分恢复Nrf2表达。同时，Nrf2下游抗氧化基因Gclc、Nqo1和Hmox1的mRNA水平在ADHD样小鼠中降低，PE暴露进一步抑制，褪黑素在高剂量PE组显著恢复（p < 0.05）。这些发现表明PE共暴露抑制PFC中PI3K/AKT1/GSK3β/Nrf2信号，而褪黑素部分恢复通路活性和Nrf2依赖的抗氧化防御。为确定这些分子改变是否限于PFC还是扩展到另一个ADHD相关多巴胺能区域，研究人员还检查了纹状体中的关键多巴胺能和信号蛋白。纹状体TH和DRD1蛋白表达在ADHD样小鼠中降低并在PE共暴露后进一步下降，而褪黑素部分恢复两者（p < 0.05）。与PFC发现一致，PI3K p85、AKT1和GSK3β的磷酸化在尼古丁和PE共暴露后逐渐降低，而总蛋白丰度基本不变。褪黑素部分恢复这些信号蛋白的磷酸化。同时，纹状体Keap1表达在尼古丁暴露后增加，Nrf2表达降低，并被PE共暴露进一步改变，而褪黑素部分逆转这些变化。这些发现表明PE相关的多巴胺能功能障碍和PI3K/AKT1/Nrf2相关信号抑制不限于PFC，还扩展到纹状体，提示更广泛的ADHD相关多巴胺能脑区参与。
最后，研究人员检查减少PFC中PIK3CA表达是否会减弱褪黑素的行为和抗氧化效应。评估了三个靶向PIK3CA（编码class IA PI3K的p110α催化亚基）的AAV递送shRNA构建体。所有三个构建体均降低p110α蛋白表达，选择敲低效率最高的shRNA3用于后续实验。PIK3CA敲低未显著影响三箱实验第0阶段的总移动距离或穿梭次数，表明一般运动活性保持。褪黑素显著改善高剂量PE暴露ADHD样小鼠的社交和社交新奇偏好，而这些改善在PIK3CA敲低后明显减弱。类似地，褪黑素恢复PFC GSH水平并增加NQO1、GCLC和HO-1表达，这些效应均被PIK3CA敲低显著削弱。总之，这些发现表明PE暴露破坏前额叶多巴胺稳态并抑制ADHD样小鼠PI3K/AKT1/Nrf2信号，而褪黑素部分恢复通路活性、Nrf2依赖的抗氧化防御和行为功能。PIK3CA敲低后这些保护作用的减弱提供了功能证据表明PIK3CA信号参与褪黑素的保护作用。然而，由于敲低不完全且不限于特定神经细胞群体，这些实验不能确定完整的通路必要性或识别负责观察效应的神经元或胶质细胞群体。
**讨论部分总结**
在讨论部分，研究人员指出，在当代工业化世界中人类沉浸在无处不在的塑料环境里。微塑料已成为普遍的环境污染物，已在人体血液、胎盘、脑组织和众多其他生物基质中检测到。在人体生物监测鉴定的聚合物中，PE始终是最常检测到的，在近期研究中约占血液微塑料的30%，这归因于其作为全球产量最高的塑料以及其在食品包装、玩具、奶瓶和家庭用品中的主要用途。儿童代表独特脆弱的群体。尽管存在生物学合理性，循环微塑料与儿童神经发育障碍（特别是ADHD）的相关性仍知之甚少。在初步队列中，PE在ADHD患儿中显示最显著的增加，其相对丰度和血液浓度而非颗粒大小与ADHD状态相关。循环PE浓度在轻度、中度和重度临床亚组中增加并与SNAP-IV和Conners T评分正相关，表明严重程度相关梯度。然而，横断面设计排除了关于时间性或因果性的结论，这些观察应视为假设生成性并支持进一步前瞻性和实验性研究。
氧化应激和神经炎症代表微塑料毒性与ADHD生物学交叉的汇聚病理生理节点。微塑料通过特征性氧化级联诱导毒性。与之一致，ADHD患儿表现出降低的GSH水平、增加的MDA水平和升高的IL-6，在重度亚组中改变最明显。代谢组学改变进一步汇聚于连贯的脂质-氧化还原破坏级联。升高的AA/EPA比值反映利于炎症而非消退的膜环境。这种促氧化偏移进一步由增加的8-异前列腺素F2α证实。总之，这些发现支持自我延续模型：微塑料诱导的ROS消耗膜omega-3 PUFA并氧化富含AA的甘油磷脂，产生如8-异前列腺素F2α的产物放大神经炎症，进而产生更多ROS，持续膜损伤并加剧ADHD特征的omega-3缺陷促炎脂质谱。
多条独立证据汇聚于PI3K/AKT1/Nrf2信号作为PE暴露和ADHD相关生物学改变中的候选通路。网络毒理学鉴定AKT1、PIK3CA、NFE2L2和IL6为PE相关和ADHD相关基因集之间的中心共享基因，而孟德尔随机化显示遗传预测AKT1表达与ADHD风险之间的名义负相关。重要的是，MR分析评估遗传代理基因表达与ADHD易感性之间的关系，不直接评估PE暴露或确定AKT1介导PE暴露与ADHD之间的关联。因此MR发现应解释为AKT1靶点优先化和机制三角验证的支持性证据而非PE暴露通过AKT1在人类中发挥作用的证明。在五个评估的候选物中，褪黑素显示最低有效浓度并挽救PE暴露诱导的行为、分子和代谢异常。褪黑素通过PI3K/AKT/Nrf2信号的神经保护作用已在多个神经疾病模型中独立记录。重要的是，褪黑素给药时机应与治疗范式区分。在本研究中褪黑素与尼古丁和PE在整个发育暴露期E1.5至P21同时给药，而非在ADHD样表型建立后开始。因此研究发现证明褪黑素对PE相关神经行为和分子异常发展和加剧的预防性或保护性作用，但不确立逆转已建立ADHD样表型的治疗效果。
为在体内验证汇聚的人体和计算证据，研究人员使用围产期尼古丁暴露建立神经发育脆弱背景并检查早期PE暴露是否加剧ADHD相关表型。重要的是，PE单独暴露在独立队列中未产生三箱社交互动实验或5-CSRTT中可检测的异常。这些发现支持二次打击模型，即PE暴露放大预先存在的神经发育脆弱性而非在本暴露条件下独立产生明显ADHD样表型。5-CSRTT的加入实质性加强了模型的行为表征。行为异常伴随儿茶酚胺能信号破坏。重要的是，纹状体中PI3K、AKT1和GSK3β的磷酸化显示与PFC中观察到的变化平行，伴随Keap1增加和Nrf2表达降低。这些发现表明PE相关的多巴胺能和氧化还原信号异常不限于PFC而扩展到纹状体。Nissl染色和BDNF分析进一步证明神经元损伤。CETSA分析进一步加强了机制证据的靶点水平一致性。重要的是，CETSA反映配体相关或相互作用相关的蛋白稳定化，不独立确立直接物理结合。然而分子对接、分子动力学、PIK3CA特异性CETSA和功能性PIK3CA敲低的汇聚支持p110α作为褪黑素保护作用的候选上游介质。
微塑料诱导的ROS已被证明在多个器官系统中失调PI3K/AKT和Nrf2信号，确立氧化通路破坏作为微塑料毒性的保守机制。在本研究中PE暴露剂量依赖性抑制PFC中PI3K、AKT1和GSK3β（Ser9）磷酸化而不改变总蛋白水平，表明PE靶向通路激活而非表达。PE同时上调Keap1，Nrf2通过两个互补臂被抑制。这种双重抑制在发育中的大脑中尤其重要。与之一致，PE暴露小鼠显示前额叶IL-6、IL-1β、TNF-α和MDA升高以及SOD和GSH降低。这些发现描绘了一个恶性信号循环。最后，AAV介导的PFC中PIK3CA敲低明显减弱褪黑素的行为和抗氧化益处。这些发现提供功能证据表明PIK3CA信号参与褪黑素的保护作用。总之，数据支持PI3K/AKT1/Nrf2信号作为重要机制节点，早期PE暴露通过该节点放大脆弱ADHD样大脑中的氧化炎症和多巴胺能功能障碍。
**结论翻译**
总之，本研究提供了跨物种证据，将循环PE微塑料负荷与儿童ADHD相关临床和生物学特征联系起来，并在PNE小鼠模型中证明发育期PE共暴露加剧与PI3K/AKT1/Nrf2信号受损、抗氧化防御减弱、脂质稳态破坏、神经炎症和多巴胺稳态改变相关的行为、分子和代谢异常。同时给予褪黑素通过恢复PI3K/AKT1/Nrf2信号部分减轻这些异常，而AAV介导的PIK3CA敲低明显削弱其保护作用，支持PIK3CA信号对褪黑素相关神经保护的功能贡献。总体而言，人体研究发现支持循环PE负荷与ADHD相关神经发育脆弱性之间的关联，而动物实验提供机制证据表明发育期PE暴露可在易感背景中加剧ADHD样表型。这些发现强调PI3K/AKT1/Nrf2信号作为与微塑料相关发育神经毒性和预防性神经保护相关的重要机制通路。
