《Advanced Science》：Cross-Organ Multi-Omics Profiling of Systemic Alterations in 5xFAD Mice and Changes Associated with Huanglian Jiedu Decoction Treatment
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阿尔茨海默病（AD）日益被认为是一种涉及脑外代谢异常的系统性疾病，但肝脏改变与神经炎症之间的联系尚不清楚。研究人员对雄性小鼠进行行为学、组织病理学、转录组学、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和代谢组学整合分析，小鼠被分配至野生型（WT，n=15）、AD（n=16）
阿尔茨海默病（AD）日益被认为是一种涉及脑外代谢异常的系统性疾病，但肝脏改变与神经炎症之间的联系尚不清楚。研究人员对雄性小鼠进行行为学、组织病理学、转录组学、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和代谢组学整合分析，小鼠被分配至野生型（WT，n=15）、AD（n=16）、高剂量黄连解毒汤（HLJDD，n=16）、低剂量HLJDD（n=11）和多奈哌齐（n=10）组，处理10周。纵向行为学数据采用重复测量模型分析，组学p值采用Benjamini–Hochberg错误发现率（FDR）程序校正。认知障碍、胶质细胞激活和神经炎症伴随肝脏代谢紊乱以及胰岛素信号和能量代谢改变，提示过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）相关过程参与其中。HLJDD，尤其是高剂量，改善了行为学和神经病理学结局，并使三羧酸循环（TCA）代谢物、氨基酸类神经递质和氧化平衡的异常向WT水平回转。为评估肝细胞对小胶质细胞炎症的贡献，研究人员建立了AML12–BV2条件培养基模型并进行肝细胞PPAR-γ敲低。经脂多糖（LPS）/HLJDD共处理的AML12细胞条件培养基在BV2细胞中引起的炎症反应低于LPS处理肝细胞的条件培养基。PPAR-γ敲低减弱了这一效应，支持肝细胞PPAR-γ依赖性参与小胶质细胞调控，并支持进一步研究肝脏参与HLJDD相关神经保护的作用。
研究背景：阿尔茨海默病（AD）是进行性神经退行性疾病，主要表现为认知功能下降和行为障碍，是最常见的痴呆类型。全球人口老龄化加速使AD发病率不断上升，带来日益加重的社会经济负担。AD病因和发病机制涉及多因素复杂交互，淀粉样β蛋白（Aβ）聚集、tau过度磷酸化、神经炎症、铁死亡和氧化应激等过程均被牵涉，但疾病启动和进展机制仍未完全阐明。现有治疗选择有限，多数仅提供症状获益或有限地改变疾病进程。衰老是AD主要危险因素，常伴随代谢率下降；AD患者脑内葡萄糖摄取受损是最具特征性的缺陷之一，且脑能量代谢改变可在典型AD病理特征出现之前发生，提示代谢失调可能参与神经退行性变的早期阶段。越来越多证据将AD与脑胰岛素抵抗相联系，即所谓“3型糖尿病”，并提示外周器官与中枢神经系统（CNS）之间存在炎症与代谢的协同交互。既往AD研究多聚焦于CNS内在机制，但近期发现强调外周器官在维持正常脑功能和影响脑疾病发病中的重要作用。肝脏作为机体代谢枢纽，对全身葡萄糖和脂质稳态至关重要，近期被视为AD进展的重要贡献者，支持AD是由基因-环境交互塑造的系统性疾病这一观点。近期研究提示肝功能异常与AD进展相关，肝功能受损患者血浆Aβ水平显著升高；肝脏在生理条件下清除血液中的Aβ并调节脑内Aβ水平；衰老相关肝源性载脂蛋白E4（ApoE4）向脑内浸润使肝脏成为关键治疗靶点；慢性肝脏炎症和氧化应激进一步破坏血脑屏障（BBB），促进神经毒性代谢物入脑。肝-脑轴可能在AD中形成恶性循环，即外周代谢功能障碍加重脑淀粉样沉积、神经炎症和线粒体衰竭。中医（TCM）通过多组分、多靶点调控恢复系统平衡，为AD提供整体策略；根据中医理论，AD虽表现于脑，但其病机与脏腑功能障碍密切相关，虚、浊、滞、毒共同导致脑失所养和认知下降。基于此框架，具有1600余年历史的经典清热解读方黄连解毒汤（HLJDD）被广泛用于AD治疗。研究团队既往研究表明HLJDD在AD模型中具有显著治疗前景，可调节肠道菌群、减轻神经炎症并恢复代谢稳态，但HLJDD调控跨器官通讯的精确系统机制仍知之甚少。本研究旨在阐明AD中外周与CNS炎症中糖代谢紊乱的级联机制，采用多组学分析整合不同靶器官，并进一步检验HLJDD相关的肝脏炎症和代谢状态改变是否伴随小胶质细胞炎症反应改变，包括通过肝细胞-小胶质细胞条件培养基模型进行验证。最终，本研究提供生物信息学网络以量化HLJDD对特定调控节点的贡献，为AD治疗提供新见解和方法学。
研究人员开展的研究及结论：研究整合行为学、组织病理学、转录组学、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和代谢组学分析，对5xFAD小鼠脑、肝、血清进行跨器官多组学解析，并评估HLJDD干预效应。主要发现为5xFAD小鼠脑与肝之间存在显著病理趋同：PPAR信号和胰岛素相关通路是两器官失调的中心节点；脑表现以小胶质细胞Itgax/CD11c和星形胶质细胞GFAP激活为标志的神经炎症表型，肝则发生能量和脂质代谢的重大重编程，支持AD与涉及脑和肝的协同中枢-外周代谢改变相关。血清代谢组学揭示氨基酸和脂质紊乱与组织特异性胰岛素敏感性和能量稳态缺陷相平行；磷酸化蛋白质组学显示脑内IRS家族成员和肝内Insr Ser1054磷酸化改变，与上游胰岛素相关信号失调一致，此模式会抑制PI3K/Akt及下游mTOR和AMPK等效应器，提示该模型中的胰岛素抵抗涉及翻译后重编程而非仅配体缺乏；两组织中NF-κB组分磷酸化水平激活进一步支持炎症与代谢抵抗的相互关系；转录组学与代谢组学整合定义了代谢-免疫枢纽。行为学和组织病理学发现与分子改变一致：5xFAD小鼠体重较低、空间学习记忆受损、焦虑样行为增加，组织学和免疫组织化学证实神经元损伤及Aβ和PS1相关病理增加；HLJDD尤其高剂量和多奈哌齐改善行为表现并减轻神经元变性，高剂量HLJDD还减少斑块沉积及异常Aβ和PS1表达。免疫失调是该模型主要特征，脑转录组学显示WT与AD间差异表达基因（DEGs）主要富集于免疫和炎症通路，HLJDD与AD间DEGs富集于淋巴细胞趋化，提示趋化因子信号改变可能影响脑内免疫细胞分布并影响疾病进展；多重免疫荧光显示海马和皮质中Aβ、IBA1和GFAP共定位，HLJDD减少三者阳性染色；AD脑内Ly86、Cd68和Itgax显著上调并被HLJDD下调；促炎细胞因子包括TNFα、IFNγ、IL-12A、IL-1β和IL-6在AD组脑和肝中均升高，HLJDD干预后降低。PPAR信号是脑和肝同时改变的途径之一，转录组学显示HLJDD处理后PPAR相关信号富集，肝内PPAR-α和PPAR-γ是脂质和葡萄糖稳态的重要调节因子，PPAR信号紊乱可能促成全身代谢异常；本研究中PPAR-γ在5xFAD小鼠脑和肝中较WT降低，HLJDD处理后部分恢复。该通路还与胆固醇稳态交叉，PPAR-γ调控包括Abca1和Abcg1在内的胆固醇外流基因，本研究中Abca1和Lxrβ在AD组脑和肝中均显著降低，HLJDD显著上调Abca1和Lxrβ，提示改善胆固醇转运有助于其保护效应；同时HLJDD增强脑和肝中Pik3ap1、Akt1和Nos3表达。多组学整合识别的胰岛素抵抗表型得到转录组和代谢组改变进一步支持，血清代谢组学显示AD与WT间差异代谢物（DEMs）集中于与胰岛素抵抗相关的能量代谢通路，而HLJDD更广泛影响糖酵解、胰岛素抵抗和脂质代谢；脑HLJDD与AD间DEGs富集于胰岛素抵抗通路，肝DEGs富集于糖尿病相关信号。代谢通路分析进一步揭示脑和肝的协同代谢改变，AD组脂质、氨基酸和能量代谢显著改变；HLJDD上调包括Pck1、Fbp1和Atp2a1在内的能量代谢和细胞稳态相关基因；脑和肝共同富集嘌呤代谢和维生素B6代谢进一步提示共享病理网络；靶向代谢组学为能量中心机制提供额外支持，HLJDD调节脑和肝中TCA循环代谢物，调节苯丙氨酸、天冬酰胺、5-羟色氨酸和褪黑素，并在两组织中增加琥珀酸。意义：本研究将多组学分析与行为学、组织病理学和细胞分析相结合，表征5xFAD小鼠脑和肝改变及其对HLJDD的响应；HLJDD改善认知表现和神经病理结局，伴随两组织炎症信号和代谢谱改变；条件培养基实验显示HLJDD处理LPS暴露肝细胞可改变BV2细胞后续炎症反应，敲低实验提示肝细胞PPAR-γ可能参与其中；这些发现将治疗响应的脑和肝改变与体外肝细胞-小胶质细胞效应的功能证据相联系，支持进一步研究肝脏对HLJDD相关神经保护的贡献。论文发表在《Advanced Science》。
关键技术方法：研究采用5xFAD转基因雄性小鼠（4月龄，购自上海南方模式生物）与年龄和遗传背景匹配的C57BL/6J野生型小鼠，设WT、AD、高剂量HLJDD、低剂量HLJDD和多奈哌齐组处理10周；行为学评估采用Morris水迷宫（MWM）、高架十字迷宫（EPM）和旷场实验（OFT）；组学分析包括脑和肝转录组RNA测序（Illumina NovaSeq 6000）、基于数据非依赖采集（DIA）的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学（Orbitrap Astral）、脑/肝/血清非靶向代谢组学（UHPLC-LTQ-Orbitrap MS）及靶向代谢组学；组织学采用H&E、刚果红、免疫组织化学和免疫荧光；分子验证采用qRT-PCR、Western blot和生化标志物检测；体外建立AML12肝细胞–BV2小胶质细胞条件培养基模型并结合PPAR-γ siRNA敲低；HLJDD成分采用LC-MS鉴定。
研究结果：
2.1 多组织转录组学提名5xFAD小鼠系统性免疫激活和代谢失调：对肝和脑组织进行转录组分析，5xFAD脑内鉴定462个DEGs，功能富集显示主要参与免疫和炎症反应、胰岛素抵抗、脂质代谢和能量代谢，显著富集于PPAR和PI3K/Akt信号通路；GSVA和ssGSEA进一步支持AD相关神经炎症特征，尤其小胶质细胞激活；RT-PCR验证免疫相关基因在AD组显著上调，Itgax显著升高；GSEA提示小胶质细胞功能异常；免疫荧光显示活化IBA1阳性小胶质细胞和GFAP阳性星形胶质细胞密集环绕Aβ斑块。肝组织检测573个DEGs（372下调、201上调），富集分析显示糖尿病相关通路、能量代谢和脂质代谢显著改变；PPAR和胰岛素相关通路在脑和肝中均富集，提示中枢和外周分子改变协同。
2.2 整合蛋白质组和磷酸化蛋白质组学表征5xFAD小鼠跨组织信号和磷酸化相关改变：脑组织鉴定8189个蛋白质，磷酸化蛋白质组鉴定6410个蛋白质上46711个磷酸化位点；AD脑鉴定216个差异表达蛋白（DEPs，154上调、62下调）和4451个差异磷酸化位点（DPPs，2624上调、1827下调）。脑DEPs富集于NF-κB信号、IL-17信号、补体和凝血级联等免疫炎症通路，以及PI3K-Akt和胰岛素信号通路；GO富集显示固有免疫反应、小胶质细胞激活、吞噬作用和PI3K/Akt级联正调控；DPPs核心通路为磷脂酰肌醇信号系统，AKT1调控位点磷酸化显著改变；转录组与蛋白质组整合显示DEGs和DEPs在代谢相关通路显著共富集。磷酸化蛋白质组比较显示AD组IRS家族抑制性磷酸化（Irs1 Ser444；Irs2 Ser965/976/1153）和AKT负调控因子Phlpp1（Ser313/1482）磷酸化，伴下游mTOR（Ser2069）和能量感受器Prkaa1（Thr488/490）磷酸化下调；糖原合酶Gys1（Ser652/653/657）磷酸化协同上调；Nfkb1（Ser447）、Tab3（Thr408）和Plcg1（Ser18）磷酸化增加。肝组织鉴定6516个蛋白质和27154个磷酸化位点，240个DEPs和2664个DPPs，肝DEPs主要富集于PPAR、胰岛素和AMPK信号通路及脂肪酸和脂质代谢；肝DPPs主要富集于PPAR信号通路；肝胰岛素抵抗表现为Insr（Ser1054）、Irs1（Ser318/1097）和Irs2（Ser385/675/907/1165）抑制性磷酸化增加及Irs1（Tyr891）激活磷酸化降低；Map3k7（Thr417）磷酸化增加促进下游NF-κB亚基Rela（Ser238）激活；脂代谢改变包括Ppargc1b（Ser233）、Fabp1（Ser100）和β-氧化酶磷酸化下调及脂滴蛋白Plin1/Plin5磷酸化上调。脑和肝重叠磷酸蛋白比较显示两组织NF-κB相关蛋白磷酸化增加一致，而IRS1在肝中Tyr891磷酸化降低、在脑中丝氨酸磷酸化改变，提示共享分子框架内的组织特异性调控。
2.3 非靶向代谢组学鉴定5xFAD小鼠脑、肝和血清协同代谢特征：采用UHPLC-LTQ-Orbitrap MS进行非靶向代谢组学，样品经液-液萃取分为高极性和低极性组分，分别用HILIC和RP-C18柱分离，正负离子模式采集；QC样品保留时间和峰强度高度一致证实仪器稳定性。脑DEMs主要富集于神经退行性变、氨基酸、脂质和嘌呤代谢及AMPK和PI3K-Akt信号通路；肝DEMs主要与氨基酸、氮和不饱和脂肪酸代谢相关。血清代谢组学显示DEMs主要富集于氨基酸和能量代谢通路，包括胰岛素抵抗相关通路。
2.4 HLJDD减轻5xFAD小鼠认知缺陷、Aβ负荷和神经病理改变：LC-MS推定表征HLJDD中230个化合物，主要为生物碱、黄酮、环烯醚萜和酚酸；单次口服后2 h生物样品中推定鉴定35个HLJDD相关化合物（31个原型成分和4个代谢物），血浆31个、肝30个、脑8个。行为学显示AD组在MWM空间探针试验中目标象限时间和距离百分比低于WT，Don和H-H组高于AD组且平台穿越次数增加，H-L与AD组无显著差异；EPM中AD组闭臂进入次数多于WT，H-H组少于AD组；OFT中AD组运动直线性、总距离和中央区时间减少、粪便粒数增加，H-H组中央区活动时间和停留时间增加。HE染色显示AD组海马和皮质神经元变性坏死、淀粉样斑块沉积和小胶质细胞增生，H-H组斑块沉积减少，H-L组病理改变与AD相似；刚果红、Aβ和PS1阳性染色在AD组显著高于WT，H-H组皮质刚果红、Aβ和PS1阳性面积显著减少，H-L组Aβ和PS1阳性面积显著减少但不如H-H显著。
2.5 HLJDD部分恢复5xFAD小鼠PPAR信号和免疫代谢调控相关转录组特征：HLJDD-vs-AD脑内鉴定437个DEGs（213下调、224上调），16个AD上调基因被HLJDD显著下调，12个AD下调基因被恢复上调；肝组织HLJDD干预调节263个DEGs；HLJDD处理组DEGs富集于炎症免疫、氨基酸代谢、能量代谢和PPAR信号通路；肝DEGs主要富集于氨基酸和能量代谢。转录组分析进一步显示AD脑内强烈免疫激活及脑和肝PPAR通路和糖尿病/胰岛素相关通路一致失调，提示HLJDD可能通过激活PPAR通路调节代谢稳态并减轻AD炎症反应。
2.6 HLJDD处理与脑和肝组织胰岛素和炎症信号磷酸化蛋白质组重塑相关：HLJDD处理后AD小鼠脑组织鉴定102个DEPs（44上调、58下调）和3446个DPPs（2040上调、1406下调）；脑DEPs KEGG富集显示NF-κB信号和胞葬作用等免疫炎症通路富集，以及视黄醇代谢、苯丙氨酸代谢和胰岛素分泌通路；GO富集包括急性炎症反应正调控、化学突触传递和多巴胺能突触传递及多巴胺代谢过程。脑内HLJDD处理与胰岛素相关磷酸化模式改变相关，Irs1（Ser444）和Irs2（Ser976和Ser1153）磷酸化水平下调，Tbc1d4（Ser324和Ser764）和Gsk3b（Tyr323）磷酸化增加，Phlpp1（Ser293）磷酸化降低；能量代谢方面Prkaa1（AMPKα1，Thr382）和Eif4b（Ser409和Ser422）磷酸化增加；磷酸化蛋白质组显示糖酵解/糖异生、TCA循环和磷酸戊糖途径富集。肝组织检测159个DEPs和2443个DPPs，主要富集于PPAR信号通路、AMPK信号通路、胰岛素分泌通路和II型糖尿病相关通路，以及花生四烯酸代谢、谷胱甘肽代谢和非酒精性脂肪肝病相关通路；HLJDD与肝Insr（Ser1054）和Irs1/2磷酸化改变相关，上调Akt2（Thr451）激活位点磷酸化并恢复下游Gys1和Foxo1磷酸化修饰，降低Map3k7（Thr417和Ser389）和Rela（p65，Ser238）磷酸化；脂代谢方面降低Plin5和Plin1磷酸化、增加Fabp1和Ppargc1b磷酸化。胰岛素分泌通路在脑和肝中均富集，提示两器官胰岛素相关信号共享改变。
2.7 HLJDD处理与5xFAD小鼠中枢和外周代谢特征重塑相关：PCA显示各组织实验组间清晰分离；HLJDD给药后脑DEMs主要集中于氧化磷酸化、氨基酸代谢、脂质代谢和嘌呤代谢等关键代谢通路，AMPK和PI3K-Akt信号通路也显著受影响；肝内AD与HLJDD间DEMs主要富集于氨基酸代谢、嘌呤代谢和氮代谢；血清比较中DEMs富集于糖酵解、胰岛素抵抗、氨基酸代谢、能量代谢和脂质代谢通路。
2.8 HLJDD通过抑制胶质激活和促炎细胞因子释放减轻系统性炎症：多组学转录组和蛋白质组分析显示脑DEGs/DEPs主要富集于免疫和炎症相关信号通路；ssGSEA显示HLJDD处理小鼠脑内星形胶质细胞激活和小胶质细胞激活评分改变；GSEA和基因表达热图提示HLJDD调节星形胶质细胞分化通路及其核心基因表达；RT-PCR显示HLJDD显著逆转Ly86、Cd68和Itgax表达水平；免疫荧光显示5xFAD小鼠海马和皮质Aβ、IBA1和GFAP水平显著升高，HLJDD显著减少Aβ积累并减轻小胶质细胞和星形胶质细胞异常激活。
2.9 HLJDD恢复中枢和外周能量代谢及氧化还原平衡：脑转录组GSEA显示AD组TNFα产生显著升高，RT-PCR验证AD模型脑组织TNFα、IFN-γ、IL-1β和IL-6 mRNA水平显著增加，HLJDD显著降低这些细胞因子mRNA表达；AD小鼠脑和肝IL-6 mRNA均显著增加，表明中枢和外周炎症反应一致；生化分析显示AD小鼠中枢和外周NO水平降低伴GSH降低、SOD升高和4-HNE含量升高，表明抗氧化能力下降和脂质过氧化产物积累的氧化应激状态；HLJDD干预显著恢复NO水平，尤其肝组织具统计学显著性，同时降低脑组织氧化应激生物标志物。
2.10 HLJDD对5xFAD小鼠中枢和外周能量代谢的影响：脑和肝转录组与代谢组分析共同揭示能量代谢通路紊乱；生化检测显示AD组脑和肝葡萄糖水平显著降低而乳酸升高，HLJDD使这些紊乱的葡萄糖和乳酸水平正常化；基于HLJDD与AD组DEGs前30个蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，PCR验证显示AD小鼠脑和肝中Adipoq（与胰岛素抵抗密切相关的基因）表达显著升高，HLJDD有效抑制其过表达；HLJDD上调脑组织葡萄糖代谢相关基因（Pck1、Fbp1、Atp2a1）并正常化Fabp4、Lep和Elk1失调，肝组织中显著调节Ugt1a9、Hes1和Obp2a表达。脑代谢组学显示HLJDD显著调节5xFAD小鼠中枢碳代谢物包括NAD+、琥珀酸、AMP、3-磷酸甘油酸和柠康酸水平；肝组织中HLJDD改变柠檬酸、乌头酸和琥珀酸水平；琥珀酸作为通过IL-1β产生调节固有免疫的关键免疫代谢物并与氧化应激和能量代谢密切相关，在脑和肝中均被HLJDD同步正常化。
2.11 HLJDD调控脑和肝中PPAR-γ、PI3K/Akt、NF-κB信号通路：基因表达热图显示WT与AD组PPAR信号通路明显区分；免疫荧光显示AD组海马和皮质PPARγ阳性染色强度较WT显著降低，HLJDD有效恢复这些脑区PPAR-γ表达；肝组织AD组PPAR-γ染色强度显著降低，HLJDD处理后显著增加；RT-PCR验证显示HLJDD不仅增加Abca1和Lxrβ表达，还显著上调脑和肝中Pik3ap1、Akt1和Nos3基因水平；免疫组化显示HLJDD有效降低脑和肝组织NF-κB表达，表明HLJDD处理与脑和肝中PPAR-γ、PI3K/Akt和NF-κB信号协同改变相关。
2.12 HLJDD在AML12-BV2条件培养基模型中减轻炎症反应且可能涉及肝细胞：跨器官多组学和组织水平验证鉴定5xFAD小鼠肝和脑PPAR相关免疫代谢改变；通路评分显示HLJDD处理后PPAR、PI3K-AKT-mTOR和炎症相关特征呈组织和组学依赖性方向改变；配体-受体和血清代谢物分析进一步提名肝与脑分子反应间的潜在联系。建立AML12肝细胞-BV2小胶质细胞条件培养基模型，基于CCK-8选择HLJDD浓度2.5、7.5和25 μg/mL；LPS刺激AML12细胞中HLJDD浓度依赖性降低TNF-α、IL-1β和IL-6释放；免疫印迹显示HLJDD处理后PPAR-γ表达增加、iNOS、p-AKT和p-NF-κB p65信号降低。将各AML12处理组条件培养基（CM）转移至BV2细胞，相较于未处理AML12的CM（CM-Control），LPS刺激肝细胞的CM（CM-Model）增加BV2分泌TNF-α、IL-1β和IL-6，增加IBA1和CD68免疫荧光信号并伴iNOS表达和AKT、NF-κB p65磷酸化增加及PPAR-γ表达降低；相反，HLJDD处理LPS刺激肝细胞的CM（CM-HLJDD）减弱细胞因子释放和小胶质细胞炎症标志物反应，伴BV2 PPAR-γ丰度升高及iNOS、p-AKT和p-p65信号降低。在AML12细胞中沉默PPAR-γ后，非靶向siRNA转染细胞中HLJDD增加PPAR-γ表达而iNOS丰度和p-AKT/AKT、p-p65/p65比值较siNC-Model组呈降低趋势；PPAR-γ敲低减弱这些HLJDD相关改变，iNOS表达及AKT和p65磷酸化高于siNC-HLJDD组。供体肝细胞PPAR-γ沉默后，CM-siNC-HLJDD降低BV2释放TNF-α、IL-1β和IL-6并伴PPAR-γ表达增加、iNOS丰度降低和p-AKT/AKT、p-p65/p65比值降低；而供体AML12细胞PPAR-γ沉默削弱HLJDD相关CM限制BV2细胞因子释放和炎症信号的能力。这些条件培养基和敲低结果提示肝细胞PPAR-γ至少部分参与HLJDD处理相关的微胶质细胞炎症反应抑制，补充了5xFAD小鼠中观察到的肝-脑免疫代谢改变。
讨论部分总结：本研究主要发现是5xFAD小鼠脑与肝之间显著的病理趋同，整合转录组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组和代谢组分析鉴定PPAR信号和胰岛素相关通路为两器官失调的中心节点；脑表现以微胶质细胞Itgax/CD11c和星形胶质细胞GFAP激活为标志的神经炎症表型，肝发生能量和脂质代谢重大重编程。多组学整合进一步显示跨组织协同炎症和代谢异常，血清代谢组学揭示氨基酸和脂质紊乱与组织特异性胰岛素敏感性和能量稳态缺陷平行；磷酸化蛋白质组学显示脑IRS家族成员和肝Insr Ser1054磷酸化改变，与上游胰岛素相关信号失调一致，此模式会抑制PI3K/Akt及mTOR和AMPK等下游效应器，提示该模型胰岛素抵抗涉及翻译后重编程而非仅配体缺乏；两组织NF-κB组分磷酸化水平同时激活进一步支持炎症与代谢抵抗的相互关系；转录组与代谢组整合定义代谢-免疫枢纽，Itgax表达增加和Aβ邻近胶质激活与嘌呤和脂质紊乱同时出现，提示免疫功能障碍既响应又加重失败的代谢微环境；磷脂酰肌醇信号磷酸化水平富集也可能解释吞噬作用受损和Aβ清除缺陷；这些数据支持AD的“3型糖尿病”假说并将其扩展为同步多器官过程。行为学和组织病理学发现与分子改变一致；HLJDD尤其高剂量和多奈哌齐改善行为表现并减轻神经元变性，高剂量HLJDD还减少斑块沉积及异常Aβ和PS1表达，部分结局未达统计学显著性可能因样本量、剂量或治疗时长，但总体模式支持治疗获益；高剂量HLJDD组约为人类临床剂量十分之一，疗效强于低剂量组，与既往APP/PS1研究一致。免疫失调是模型组主要特征，脑转录组显示WT与AD间DEGs主要富集于免疫和炎症通路，与免疫功能障碍参与AD发病的证据一致；HLJDD与AD间DEGs富集于淋巴细胞趋化，提示趋化因子信号改变可能影响脑内免疫细胞分布并影响疾病进展；多重免疫荧光显示海马和皮质Aβ、IBA1和GFAP共定位，HLJDD减少三者阳性染色；基因水平Ly86、Cd68和Itgax在AD脑显著上调并被HLJDD下调；促炎细胞因子TNFα、IFNγ、IL-12A、IL-1β和IL-6在AD组脑和肝中均升高，HLJDD干预后降低。PPAR信号是脑和肝同时改变的途径之一，PPARs是参与代谢、分化、炎症和氧化应激调节的核受体，转录组分析显示HLJDD处理后PPAR相关信号富集，既往研究显示PPAR激动剂可减轻炎症和氧化应激并改善AD相关病理；肝内PPAR-α和PPAR-γ是脂质和葡萄糖稳态的重要调节因子，PPAR信号紊乱可能促成全身代谢异常；脑和肝PPAR相关基因平行富集提示协同中枢和外周改变而非确立直接器官间通讯；PPAR-γ还具有神经保护和抗炎功能；本研究中PPAR-γ在5xFAD小鼠脑和肝中较WT降低，HLJDD处理后部分恢复。该通路还与胆固醇稳态交叉，PPAR-γ调控包括Abca1和Abcg1在内的胆固醇外流基因；本研究中Abca1和Lxrβ在AD组脑和肝中均显著降低，ABCA1对逆向胆固醇转运至关重要，LXRβ作为胆固醇传感器和炎症反应调节因子，其下调预期促进细胞内胆固醇积累、膜功能障碍、神经元损伤和炎症信号；HLJDD显著上调Abca1和Lxrβ，提示改善胆固醇转运有助于其保护效应；同时HLJDD增强脑和肝中Pik3ap1、Akt1和Nos3表达。多组学整合识别的胰岛素抵抗表型得到转录组和代谢组改变进一步支持；这些发现与胰岛素抵抗促进tau过度磷酸化、加重Aβ神经毒性、损害脑葡萄糖代谢和加速神经元丢失高度相关；2型糖尿病患者AD风险增加及脑胰岛素抵抗标志物在疾病进展早期升高支持这一解释；Adipoq上调而支持脂肪酸转运和神经元能量稳态的Fabp4下调，HLJDD逆转这些趋势；HLJDD还降低Lep、Elk1和Csf3相关信号，提示部分恢复能量平衡和神经炎症稳态。代谢通路分析进一步揭示脑和肝协同代谢改变，AD组脂质、氨基酸和能量代谢显著改变，与既往异常胆固醇和磷脂代谢、氨基酸代谢失调影响神经递质合成及先于明显疾病的早期代谢紊乱报道一致；脑葡萄糖代谢受损也与Aβ积累相关；HLJDD上调包括Pck1、Fbp1和Atp2a1在内的能量代谢和细胞稳态相关基因，提示改善代谢灵活性、钙处理和神经元存活；脑和肝共同富集嘌呤代谢和维生素B6代谢进一步提示共享病理网络；靶向代谢组学为能量中心机制提供额外支持，HLJDD调节脑和肝TCA循环代谢物，调节苯丙氨酸、天冬酰胺、5-羟色氨酸和褪黑素，并在两组织中增加琥珀酸；由于促炎细胞因子可促进谷氨酰胺摄取和琥珀酸积累，炎症线粒体重编程可进一步促进琥珀酸相关细胞因子产生，该发现可能反映能量代谢与免疫激活的紧密耦合。本研究多组学分析为探索性和假设生成性，通路富集解释为反映协同分子改变而非直接通路激活或因果参与；后续靶向分析包括qRT-PCR、生化检测、免疫组化、免疫荧光和靶向代谢组学为部分组学衍生发现提供额外支持；低剂量HLJDD和多奈哌齐组用于药效学比较和阳性对照评估，完整多组学分析主要在AD模型组和高剂量HLJDD组进行，因此需要进一步研究纳入所有治疗组的可比多组学分析以更全面定义HLJDD活性成分和组织特异性机制。研究局限性包括：仅纳入雄性小鼠，限制发现对雌性的普适性；组样本量不等和一些组学及验证分析生物学重复数相对较小可能限制统计功效和精度，四天MWM习得设计可能限制检测后期或渐近空间学习差异的敏感性；多组学发现为探索性，通路富集和脑肝平行改变不能确立通路激活或因果器官间关系，缺乏所有治疗组的等效多组学分析也限制剂量相关反应和治疗机制比较；条件培养基实验支持体外肝细胞-小胶质细胞效应并提示肝细胞PPAR-γ可能参与，但介导介质及其在体内的因果贡献仍未解决，需要肝脏特异性干预阐明其与HLJDD相关神经保护的相关性，细胞免疫荧光发现需独立实验确认；HLJDD单个成分的贡献及其相互作用仍不清楚，单时间点组织代谢物测量不能确立代谢通量或时间关系，需要成分水平实验、纵向分析和代谢示踪解决这些问题。
研究结论翻译：本研究整合多组学分析与行为学、组织病理学和细胞分析，表征5xFAD小鼠脑和肝改变及其对HLJDD的响应。HLJDD改善认知表现和神经病理结局，伴随两组织炎症信号和代谢谱改变。补充条件培养基实验显示HLJDD处理LPS暴露肝细胞可改变BV2细胞后续炎症反应，敲低实验提示肝细胞PPAR-γ可能参与其中。总之，这些发现将治疗响应的脑和肝改变与体外肝细胞-小胶质细胞效应的功能证据相联系。它们支持进一步研究肝脏对HLJDD相关神经保护的贡献，而这些细胞效应的介导介质和体内相关性仍有待确立。
