《Advanced Science》：MRSA-Triggered Disassembly of an Immune-Recruiting NIR Probe for Bacterial Imaging and Clearance
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染因抗菌耐药性不断增加以及缺乏精准细菌识别与清除策略，仍是重大临床挑战。在此，研究人员报道了一种免疫招募型超分子两亲分子Dman-C11，其可经历MRSA触发的结构重组，用于可激活的细菌诊疗。Dman-C11由半花菁近红外
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染因抗菌耐药性不断增加以及缺乏精准细菌识别与清除策略，仍是重大临床挑战。在此，研究人员报道了一种免疫招募型超分子两亲分子Dman-C11，其可经历MRSA触发的结构重组，用于可激活的细菌诊疗。Dman-C11由半花菁近红外（NIR）荧光团、D-甘露糖胺免疫招募基序以及促进细菌膜结合的疏水性C11链组成。该两亲性结构驱动自发形成纳米颗粒，并通过聚集导致淬灭（ACQ）抑制荧光。与MRSA膜相互作用后，纳米颗粒解体使探针在脂质双层内重新分布，产生20倍荧光开启响应，同时在655 nm照射下恢复高效单线态氧产生。激活的光动力过程诱导铁死亡样细菌死亡，其特征为广泛的脂质过氧化和氧化性膜损伤。与此同时，D-甘露糖胺基序促进免疫细胞向细菌病原体募集，从而促进宿主辅助的细菌清除。在小鼠伤口感染和细菌性角膜炎模型中，Dman-C11实现约20倍的细菌负荷降低，且未检测到全身毒性。这种膜触发超分子解体策略建立了一种单分子诊疗方法，将细菌识别、可激活成像、光动力抗菌活性和免疫辅助清除联系起来，用于MRSA感染的精准治疗。
研究背景：抗菌耐药性的快速出现已成为全球重大健康挑战，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是持续性皮肤、软组织和眼部感染最常见的原因之一。传统抗生素有效性有限，凸显了需要能够实现精准细菌识别并提供局部抗菌活性的治疗策略。分子诊疗系统将可激活成像与抗菌干预相结合，为提高治疗特异性和减少脱靶毒性提供了有吸引力的策略。近红外（NIR）荧光成像能够实时、原位可视化病原体，具有较深的组织穿透能力，但传统探针往往信噪比低，因此可激活探针更适合精准检测。抗菌光动力疗法（aPDT）通过光诱导活性氧局部杀灭细菌，耐药风险极低。铁死亡是一种由脂质过氧化和ROS积累驱动的调节性细胞死亡形式，在光动力条件下的癌症治疗中已被广泛研究，但其在细菌杀灭中的作用仍很大程度上未被探索。金黄色葡萄球菌的细胞质膜主要由阴离子磷脂如磷脂酰甘油和心磷脂组成，是分子识别和抗菌干预的关键界面。脂质模拟基序可插入细菌膜，扰乱脂质堆积并增加膜通透性。在聚集导致淬灭（ACQ）系统中，探针最初自组装且不发光；膜插入后解体并在膜上重新分布，恢复荧光并提高信噪比。虽然此类膜靶向策略在癌症系统中已被充分研究，但其在细菌成像和治疗中的应用，尤其是针对MRSA，仍然有限。除直接杀灭细菌外，激活宿主先天免疫提供了消除残留病原体和加速感染消退的额外机制。甘露糖化支架和聚-D-甘露糖衍生物已被证明可招募免疫细胞并促进免疫介导的细菌清除。将甘露糖化基序整合到治疗剂中为调动宿主免疫对抗MRSA提供了策略，但该方法仍很大程度上未被探索。
研究人员开展了以下研究：报道了Dman-C11，一种由半花菁染料与D-甘露糖胺片段和疏水性烷基链偶联组成的两亲性NIR荧光探针。Dman-C11自组装成具有ACQ特性的纳米颗粒，在与MRSA膜相互作用时选择性解体，恢复NIR荧光并在655 nm照射下实现高效ROS产生。所得光动力效应诱导铁死亡样细菌死亡，而D-甘露糖胺片段同时促进免疫细胞招募，增强伤口和角膜感染模型中的细菌清除。通过将膜触发解体与荧光激活、光动力杀灭和免疫招募相结合，Dman-C11展示了一种单分子、免疫参与型诊疗平台，用于对抗多重耐药细菌感染。结论：研究人员开发了一种免疫招募型两亲性半花菁基分子Dman-C11，利用细菌膜触发的超分子解体来调控抗菌功能。Dman-C11在生理条件下自发组装成具有聚集导致荧光淬灭和抑制基础ROS产生的纳米颗粒。与MRSA膜结合后，超分子解体使探针在细菌膜内重新分布，恢复荧光用于高对比度细菌成像并激活光动力活性。在NIR照射下，Dman-C11产生高效单线态氧，诱导铁死亡样细菌死亡，其特征为广泛的脂质过氧化和氧化性膜损伤。同时，D-甘露糖胺基序促进免疫细胞向细菌病原体募集，从而增强宿主辅助的细菌清除。这项工作建立了一种超分子调控的单分子诊疗策略，其中细菌膜触发的结构重组控制成像激活、光动力抗菌活性和免疫辅助清除，从而在体内有效治疗MRSA感染。重要意义：该策略将细菌识别、可激活成像、光动力抗菌活性和免疫辅助清除联系于单一分子平台，为MRSA感染的精准治疗提供了新途径。论文发表在《Advanced Science》。
关键技术方法：研究人员主要采用了以下技术方法：（1）分子动力学（MD）模拟分析Dman-C11的自组装行为；（2）扫描电子显微镜（SEM）和动态光散射（DLS）表征纳米颗粒的形貌和粒径分布；（3）吸收光谱和荧光光谱测定探针的光物理性质；（4）ABDA降解实验和DCFH-DA探针检测单线态氧和ROS产生；（5）共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行细菌和细胞成像；（6）流式细胞术和CFU计数评估巨噬细胞吞噬和细菌清除；（7）RNA测序（RNA-seq）分析转录组变化；（8）小鼠MRSA感染伤口模型和细菌性角膜炎模型进行体内抗菌效力评价。样本队列来源为小鼠模型，包括MRSA感染伤口模型和MRSA诱导的角膜炎模型，以及4T1肿瘤与MRSA共存模型。
研究结果：
2.1 Dman-C11的设计、合成及自组装调控的光物理性质：研究人员设计并合成了基于阳离子供体-受体（D–A）半花菁骨架的Dman-C11，引入D-甘露糖胺部分用于免疫识别，并加入疏水性烷基链增强细菌结合。MD模拟揭示Dman-C11在水性缓冲液中自发自组装成纳米聚集体。SEM和DLS确认形成平均流体力学直径为188 nm、PDI为0.172的明确纳米颗粒。Dman-C11在PBS中荧光几乎淬灭（ACQ），而在ACN中荧光增强约23倍。与MRSA孵育后，Dman-C11 NPs显示约20倍荧光增强，zeta电位变化极小，表明疏水相互作用是探针-细菌结合的主要驱动力。在655 nm照射下，聚集状态下ABDA消耗可忽略，而ACN中发生高效降解；在1‰ RH40中Dman-C11的DCF荧光比PBS中高约5倍，比ICG高约7倍，表明解体后ROS产生增强。这些结果表明Dman-C11在聚集状态下淬灭且光动力失活，但在MRSA介导的解体后激活，实现位点特异性荧光和ROS产生。
2.2 体外和体内对革兰氏阳性菌的高选择性开启成像：CLSM显示Dman-C11 NPs在革兰氏阳性菌中强荧光激活，而在哺乳动物细胞（HepG2和HK-2）和革兰氏阴性菌中信号可忽略。高对比度图像显示膜定位积累。溶血和细胞毒性实验显示高达25 μM时RBC裂解极小，正常和癌细胞系中细胞存活率>90%，表明良好生物相容性。在小鼠MRSA感染（右大腿）和LPS诱导炎症（左）模型中，静脉注射Dman-C11 NPs后1 h内感染部位荧光激活，3 h达峰，5 h下降，炎症组织中未检测到信号。在4T1肿瘤与MRSA共存模型中，注射后5 h探针选择性积累于感染部位，肿瘤组织中信号极小。这些结果证明Dman-C11 NPs对体内细菌成像具有高灵敏度和特异性，能够区分MRSA感染与无菌性炎症和肿瘤。
2.3 免疫招募和PDT双功能抗MRSA活性：体外实验使用RAW264.7巨噬细胞和表达eGFP的金黄色葡萄球菌。与对照组相比，Dman-C11标记的细菌显著增强巨噬细胞结合和摄取，该效应在D-甘露糖阻断组中明显降低，确认CD206依赖性碳水化合物识别。CFU实验显示Dman-C11组细菌清除增强。体内免疫荧光分析显示Dman-C11处理的MRSA组感染组织中CD206和CD86信号明显增强，表明巨噬细胞招募和激活增强。在NIR照射（655 nm，200 mW cm?2）下，Dman-C11（1 μM）显示强光动力抗菌活性，细菌活力降低约7.5倍。Dman-C11还在其他金黄色葡萄球菌菌株中诱导荧光激活，并在相同照射条件下显示光动力抗菌活性。DiBAC4(3)荧光增强表明膜去极化，伴随细胞内核酸和蛋白质明显泄漏及SEM观察到的严重膜破坏。这些结果表明Dman-C11 NPs将病原体靶向与CD206介导的免疫招募和光动力细菌杀灭相结合，导致细菌清除增强。
2.4 Dman-C11介导的MRSA光动力铁死亡样过程：对经Dman-C11 NPs处理（有或无NIR照射）的MRSA进行RNA-seq。火山图分析显示NIR激活后大量转录重塑，鉴定出412个差异表达基因（DEGs），包括248个上调和164个下调基因。GO和KEGG通路分析表明富集于代谢通路、次级代谢产物生物合成、膜相关组分和金属离子结合。糖酵解和丙酮酸代谢相关基因显著下调，表明缺氧适应受损。关键TCA循环基因（sucC、oforA、oforB和gltA）下调，表明ATP产生减少，而sdhA-C上调，与ROS积累一致。氧化磷酸化基因广泛失调，F型ATP酶基因（atpA-H）上调，表明对能量失衡的代偿反应。脂质代谢基因（lip、gpx、fadD）也显著改变，表明脂质稳态破坏。Liperfluo染色显示Dman-C11 NPs联合NIR照射处理的细菌中脂质过氧化显著增加。同时，细胞内GSH水平进行性下降，Gpx活性和TrxR活性降低，表明细菌抗氧化防御系统减弱和与铁死亡相关的氧化还原失衡。细胞内ATP水平也显著降低。这些发现支持Dman-C11 NPs在NIR照射下诱导ROS驱动的细菌死亡，伴随铁死亡样特征。
2.5 Dman-C11 NPs抗菌活性的体内验证：在MRSA感染伤口和角膜炎模型中进一步验证。建立MRSA感染开放性伤口模型，小鼠感染后24 h随机分为四组：PBS、PBS+激光、Dman-C11和Dman-C11+激光。第1、3、5天局部滴加治疗（100 μL，10 μM），相应组进行NIR照射。Dman-C11联合NIR照射显著加速伤口闭合，第13天仅Dman-C11+激光组完全愈合，其他组残余伤口面积大2-3倍。感染部位CFU计数在Dman-C11+激光组比对照组降低20倍。H&E染色显示Dman-C11+激光组炎症细胞浸润减少，Masson三色染色显示胶原纤维沉积增强，免疫组化显示CD31表达降低，免疫荧光显示TNF-α和IL-1β水平降低。在MRSA诱导的角膜炎模型中，Dman-C11联合NIR照射明显减轻角膜混浊和炎症，第7天角膜表面更清晰，疗效与氧氟沙星相当。CFU计数显示Dman-C11+激光组细菌负荷比对照组降低约15倍。组织学分析确认治疗组角膜结构保存和组织损伤减少，与抗生素治疗组相当。这些结果表明Dman-C11介导的aPDT有效降低MRSA诱导角膜炎中的细菌负荷并保护角膜结构。
讨论部分总结：研究人员开发了一种免疫招募型两亲性半花菁基分子Dman-C11，利用细菌膜触发的超分子解体调控抗菌功能。Dman-C11在生理条件下自发组装成具有ACQ和抑制基础ROS产生的纳米颗粒，与MRSA膜结合后解体使探针重新分布，恢复荧光用于高对比度成像并激活光动力活性。NIR照射下产生单线态氧诱导铁死亡样细菌死亡，D-甘露糖胺基序促进免疫细胞招募增强宿主辅助清除。该工作建立了超分子调控的单分子诊疗策略，其中细菌膜触发结构重组控制成像激活、光动力抗菌活性和免疫辅助清除，实现MRSA感染的有效体内治疗。
