RUNX1介导的缺氧信号损伤肌生成并促进肌病纤维化

《Advanced Science》：RUNX1-Mediated Hypoxic Signaling Impairs Myogenesis and Promotes Fibrosis in Myopathies

　　

肌源性修复受损伴纤维化增强在肌病（myopathies）中十分常见，包括肉鸡的木胸肌病（Wooden Breast，WB），但二者共存的潜在机制仍不清楚。研究人员以WB肌病为模型，探究这些共存特征的共同病理起源。单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）结果显示，WB样本中肌纤维的氧化应激与促纤维化重塑增强，卫星细胞（satellite cells，SCs）增殖增加但分化降低，成纤维细胞（fibroblasts，FBs）的纤维化分化加重。差异基因表达（differentially expressed genes，DEGs）与拟时序轨迹（pseudotime trajectory）分析进一步鉴定出RUNX1是SCs与FBs共同的关键调控因子，并在相应细胞培养模型的功能研究中得到进一步支持。此外，血流灌注减少与氧供应降低可能提示WB肌肉处于缺氧状态，该状态与RUNX1表达增强相关。一致地，在分化的人肌肉FBs及各类疾病肌肉中均发现HIF1A与RUNX1表达协调增强。综上所述，研究人员发现缺氧相关的RUNX1上调破坏了SCs的肌生成进程并加剧了FBs的纤维化分化，共同促成肌病的病理退行性改变。因此，靶向RUNX1有望成为肌病预防与治疗的潜在策略，相关干预尚待未来体内研究验证。

一、研究背景
骨骼肌承担着运动、机械支撑及全身代谢（包括葡萄糖稳态与脂质氧化）等关键功能，其功能障碍可诱发运动障碍及胰岛素抵抗等代谢紊乱。各类肌病（myopathies）中，肌源性修复受损常与纤维化增强并存，而纤维化加剧又会进一步损害肌修复进程，阐明二者共存的机制成为肌病防治的关键。木胸肌病（Wooden Breast myopathy，WB）是危害快大型肉鸡胸大肌的常见肌病，患肌表现为僵硬度增加、肌纤维变性坏死、纤维化沉积及炎症浸润，严重损害肉品质并造成重大经济损失。肌肉再生依赖驻留于肌纤维基底膜与肌膜之间的成体干细胞——卫星细胞（satellite cells，SCs）；成纤维细胞（fibroblasts，FBs）向肌成纤维细胞（myofibroblasts）的病理性转变则是纤维化的核心环节。快大型肉鸡胸肌肥大超前于毛细血管发育，造成血管化不足、灌注受限及局部缺氧；然而，缺氧如何协同扰乱SCs的肌生成进程并加重FBs的纤维化分化，此前尚未被系统阐明。
二、研究开展与主要结论
研究人员以WB肌病为模型，利用高分辨率单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing，snRNA-seq）结合体内与体外研究，发现WB肌肉血流灌注减少伴随潜在缺氧状态，RUNX1在SCs与FBs中表达均显著上调；功能获得与缺失实验证实RUNX1促进SCs的激活与增殖而抑制其分化，并加重FBs的纤维化分化；跨物种再分析显示RUNX1在分化FBs及多种肌病患者肌肉中一致高表达且与HIF1A共表达。研究认为RUNX1是肌病病理发生的关键调控因子，靶向RUNX1有望成为防治肌病的潜在治疗策略。本论文由L.Z.与T.H.完成主要研究工作，T.X.负责研究的概念化与监督，发表于《Advanced Science》。
三、关键技术方法
研究人员综合运用snRNA-seq解析正常与WB肉鸡胸肌细胞图谱；利用Monocle3开展拟时序轨迹分析，结合差异基因表达与GO/KEGG富集解析SCs与FBs病理改变；借助CellChat进行细胞间通讯分析；通过siRNA沉默与RUNX1过表达质粒实施功能获得/缺失实验，结合EdU掺入、CCK-8、Western blot、免疫荧光及RT-qPCR验证RUNX1的调控作用；通过激光散斑血流成像与血气分析评估肌肉灌注与氧合，并在1% O₂缺氧条件下处理原代SCs与鸡胚成纤维细胞系DF-1。样本为42日龄Arbor Acres肉鸡胸肌（正常组与WB组各8只），原代SCs分离自12日龄鸡胚胸肌。
四、研究结果
3.1 snRNA-seq揭示细胞组成差异：UMAP分析将正常（CON）与WB胸肌鉴定为10种细胞类型；WB组Myo2与T细胞比例升高，Myo1、FBs、SCs与内皮细胞比例下降。
3.2 WB诱导肌纤维炎症、氧化应激与促纤维化重塑：Myo2亚群上调基因富集于有氧电子传递链、超氧化物细胞反应、胶原纤维组装及炎症反应；透射电镜显示肌纤维坏死溶解、线粒体空泡化肿胀；WB肌纤维促纤维化因子分泌增强。
3.3 WB破坏SCs的肌生成进程并上调RUNX1：SCs分为静息、激活、增殖与分化四个亚群；WB组激活型比例显著升高而增殖与分化型比例下降，S期细胞比例增加；RUNX1在早期激活亚群中高表达。
3.4 WB诱导FBs纤维化分化增强伴RUNX1上调：FBs上调DEGs富集于ECM组织、胶原代谢与纤维化分化通路；拟时序分析显示WB来源FBs处于更晚的分化阶段；WB组胶原沉积显著增加；RUNX1是上调转录因子中唯一呈持续升高者。
3.5 RUNX1在初级SCs中促进激活与增殖而抑制分化：RUNX1沉默降低PCNA、Cyclin D1表达与EdU阳性细胞比例，并提高肌管融合指数与MYOG表达；过表达则相反。
3.6 RUNX1促进鸡DF-1成纤维细胞的肌成纤维细胞转变：TGF-β1诱导后，RUNX1沉默降低α-SMA与Collagen I蛋白及ACTA2、FN1、COL1A1基因表达，过表达则相反。
3.7 WB肌病中缺氧与RUNX1表达增加相关：WB肌肉血流、pO₂与sO₂显著降低；1% O₂处理24小时使SCs与FBs中HIF-1α与RUNX1蛋白水平同步升高。
3.8 WB破坏细胞间信号通讯：WB组细胞互作数量增加，FBs是最主要的信号发出与接收细胞；TGFB与MDK信号对在FBs与SCs、肌纤维间一致增强；缺氧处理上调FBs中TGFB1与TGFB3，缺氧FB条件培养基提高SCs中TGFBR1与TGFBR2表达。
3.9 人类与小鼠肌肉中RUNX1表达模式一致：RUNX1在分化FBs与激活SCs中高表达并伴HIF1A高表达；肌强直性营养不良及IBM、IMNM患者肌肉中RUNX1亦上调。
五、讨论部分总结
研究人员指出，WB肌肉中显著的肌纤维肥大伴随血管密度降低与缺氧反应信号增强，潜在缺氧环境与RUNX1上调相关，WB肌肉中HIF-1α与RUNX1表达呈强正相关，功能实验表明RUNX1上调刺激SCs激活与增殖并抑制其分化。在鸡成纤维细胞培养模型中，RUNX1促进FBs肌成纤维细胞转变并增加抗肌源性因子分泌，但该现象尚需在成年肌肉驻留成纤维细胞中验证。SCs肌生成进程的破坏与肌源性微环境的破坏共同导致肌纤维坏死与结构恶化。人类与小鼠肌病的比较转录组分析显示HIF-1α与RUNX1的共表达模式在物种间高度守恒，提示RUNX1可作为未来体内治疗靶向研究的候选分子。此外，该横断面比较基于极端表型样本且测序文库来自混合组织，测序结果本身尚不能确立疾病的时间进程。
六、结论部分翻译
本研究以肉鸡WB肌病为模型，探究肌纤维退化和纤维化共存的病理起源。研究揭示明显的肌纤维肥大与WB肌肉中血管密度降低及缺氧反应信号增强相关。这种潜在缺氧环境伴随胸肌中RUNX1表达增加，功能实验表明升高的RUNX1刺激SCs的激活和增殖，同时抑制其分化。此外，在鸡成纤维细胞培养模型中，RUNX1促进FBs的肌成纤维细胞转变并增加其抗肌源性因子分泌，该发现需要在成年肌肉驻留成纤维细胞中进一步验证。由此导致的SCs肌生成进程破坏，以及肌源性微环境的破坏，促进了肌纤维坏死和结构恶化。人类与小鼠肌病的比较转录组分析表明HIF-1α与RUNX1的共表达模式在物种间高度守恒。总体而言，这些发现阐明了RUNX1在肌肉病理中的关键作用，并强调其作为未来体内治疗靶向研究的候选分子。