靶向肿瘤内驻留胞内菌的纳米催化免疫疗法用于三阴性乳腺癌治疗及转移抑制

《Advanced Science》：Nanocatalytic Immunotherapy Targeting Tumor-Resident Intracellular Bacteria for Triple-Negative Breast Cancer Treatment and Metastasis Suppression

　　

肿瘤内驻留胞内菌（TRIB）在三阴性乳腺癌（TNBC）中普遍存在。作为肿瘤病理微环境的组成部分，TRIB通过调控细胞增殖、代谢及免疫抑制加速TNBC进展。TRIB还通过细胞骨架重排增强循环肿瘤细胞对机械应力的抵抗能力，从而促进肿瘤转移并阻碍临床治疗。本研究开发了一种先进的靶向TRIB的治疗策略，通过消除肿瘤细胞和胞内菌、重塑肿瘤免疫及抑制转移定植来阻断TNBC进展。研究人员制备了癌细胞膜修饰的窄带隙FeSe₂纳米片，用于增强超声触发的活性氧（ROS）生成及影像引导的精准治疗。该纳米平台利用内源性H₂O₂和GSH放大化学动力学效应，诱导肿瘤细胞发生严重的氧化应激和铁死亡。损伤相关分子模式（DAMPs）和病原体相关分子模式（PAMPs）联合作用有效激活树突状细胞（DCs），并启动强效的抗原特异性T细胞免疫应答。本研究通过干预肿瘤内微生物群，为临床转移性乳腺癌的治疗提供了一种替代且具有前景的策略。

**研究背景与意义**

三阴性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌中最具侵袭性的亚型，以高复发、高转移和预后不良为特征，构成重大临床挑战。既往研究基于肿瘤微环境无菌的假设，主要关注转移过程中肿瘤细胞与宿主细胞间的相互作用。然而，越来越多的证据表明，在乳腺、胰腺和肺癌等多种肿瘤组织内存在低生物量但功能显著的微生物群落，挑战了既往关于这些组织为无菌环境的假设。值得注意的是，肿瘤内驻留胞内菌（TRIB）已被证实可直接影?响肿瘤细胞的增殖、代谢活性和侵袭潜能，同时增强免疫抑制机制并促进肿瘤远处转移。研究表明，循环肿瘤细胞（CTCs）内细菌的存在导致肌动蛋白细胞骨架的大规模重排，显著增强这些细胞在转移过程中的耐受性，使其能够抵御血行播散中固有的机械挑战，从而确保其保护并增强成功转移定植的能力。鉴于TRIB在癌症进展中的关键作用，构建一种同时消除恶性细胞及其胞内菌的治疗模式可能成为抗癌干预的创新且有效的策略。

活性氧（ROS）是一类具有显著化学反应性的氧衍生分子，能够氧化DNA、蛋白质和脂质等关键生物大分子，最终导致细胞损伤和凋亡。这种氧化损伤是根除肿瘤细胞和细菌群体的关键机制，构成了抗肿瘤和抗菌治疗策略的基础框架。作为一种新兴的ROS生成策略，声动力疗法（SDT）近年来因其非侵入性、低毒性、良好穿透性、时空可控性和可重复性等显著优势而在医学领域受到广泛关注。无机纳米材料作为新兴声敏剂已展现出巨大潜力。超声诱导这些纳米材料内电子（e^?）和空穴（h⁺）对分离，结合释放的能量促进与O₂和H₂O的氧化还原反应，导致大量细胞毒性ROS的产生。因此，进一步拓展无机敏化剂的种类、优化其结构设计并增强其在肿瘤部位的靶向蓄积，是推进SDT从基础到临床转化的关键方向。经验证据表明，SDT中ROS的生成效率取决于所用声敏剂价带和导带之间的带隙能。与具有宽带隙（3.2 eV）导致电子-空穴快速复合和ROS生成有限的经典声敏剂TiO₂相比，具有较窄带隙（1.07–1.81 eV）的SnS在超声辐照下表现出显著更高的ROS产生效率。因此，优化声敏剂设计以实现窄带隙是促进SDT中高效ROS生成的关键策略。令人鼓舞的是，ROS诱导的致死效应导致肿瘤细胞释放损伤相关分子模式（DAMPs）和TRIB释放病原体相关分子模式（PAMPs）。这些分子模式已被证明具有诱导增强免疫应答的潜力，为抑制肿瘤增殖和预防远处转移提供了坚实基础。

在此，研究人员创新性地提出了一种基于细胞膜工程化FeSe₂纳米片（MFS NSs）的肿瘤-细菌双杀免疫疗法。该纳米片由较窄带隙的FeSe₂纳米片（FS NSs）工程化而来，允许更轻松地分离声触发电子-空穴对以生成ROS，随后用4T1癌细胞膜（CCMs）进行表面修饰以实现影像引导的精准治疗。影像监测显示纳米片在肿瘤组织中高浓度蓄积后，施加超声（US）辐照诱导大量ROS生成，对肿瘤细胞和胞内菌产生致命攻击。同时，MFS启动肿瘤微环境激活的化学动力学治疗（CDT）过程，通过与细胞内H₂O₂和谷胱甘肽（GSH）相互作用诱导亚铁离子再生的自增殖循环，以放大细胞内氧化负荷并启动铁死亡。TRIB的消除显著影响免疫抑制机制的减弱，并通过降低CTCs的耐受性构成抑制远处转移过程的关键策略。值得注意的是，死亡肿瘤细胞释放的DAMPs和破坏的TRIB分泌的PAMPs可诱导强效的原位和全身抗肿瘤免疫应答，最终实现原发肿瘤的全面抑制和远处转移的显著减少。此外，MFS NSs表现出优异的生物相容性并促进有效的肾脏清除，在治疗动物中无明显的毒理学不良反应。总之，本肿瘤-胞内菌联合治疗在抑制肿瘤增殖、细菌定植和转移扩散方面展示了协同免疫治疗功效。这种以肿瘤细胞微生物组为干预靶点的策略为乳腺癌及其他转移性癌症的临床治疗提供了新颖的范式和视角。该研究发表在《Advanced Science》。

**关键技术方法**

研究人员采用水热法合成FeSe₂纳米片（FS NSs），经氨基-聚乙二醇修饰后，通过超声处理将4T1癌细胞膜（CCMs）包覆于纳米片表面制备MFS NSs。研究队列来源：收集8例TNBC患者的癌组织与癌旁组织配对样本（经重庆医科大学附属医院伦理批准，批号KX2025-KYC0541-01），进行5R 16S rRNA基因测序及生物信息学分析。建立胞内感染模型：以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，ATCC 43300）按感染复数50接种4T1细胞。技术方法包括：材料表征（SEM、TEM、XRD、Raman、XPS、XANES/EXAFS）、ROS催化性能检测（DPBF探针、EPR、TMB显色、GSH消耗）、体外细胞实验（CLSM、FCM、CCK-8、Calcein-AM/PI双染、JC-1线粒体膜电位检测）、抗菌评价（平板涂布计数法、FCM、Bio-TEM）、免疫评价（DC成熟FCM分析、ELISA细胞因子检测）、体内实验（4T1荷瘤小鼠模型、PA成像、荧光成像、抗肿瘤疗效评价、肺转移抑制评价、免疫细胞FCM分析）、转录组学分析（RNA-seq）及生物信息学分析。

**研究结果**

**TNBC患者癌组织细菌群落特征**：通过5R 16S rRNA基因测序对TNBC患者癌与癌旁配对组织进行分析，PCoA显示癌组织、癌旁组织与手术室空气对照组的微生物群落结构存在显著差异。α多样性分析表明TNBC癌组织中Chao1物种丰富度指数和Shannon物种多样性指数显著高于对照组和癌旁组，而Simpson优势和Good's覆盖度无显著差异，提示TNBC组织中细菌群落具有更高丰富度和整体多样性，但优势结构和测序深度与对照组和癌旁组织相当。门水平分析显示癌与癌旁组织细菌群落组成不同，Bacillota在癌组织中显著富集。LEfSe分析（LDA评分>3.0）鉴定出癌与癌旁组织间存在显著差异的微生物标志物：门水平上Pseudomonadota在癌旁组织富集，而Bacillota在癌组织富集；较低分类等级上Bacilli、Clostridia、Lachnospirales、Bacteroidales、Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Ileibacterium均在癌组织中显著富集。PICRUSt功能预测显示DNA复制、DNA修复与重组蛋白及核苷酸代谢（嘧啶和嘌呤代谢）相关通路在癌组织中显著富集，提示肿瘤相关微生物群可能通过调控关键代谢和生物合成过程促进肿瘤进展。16S rRNA FISH和Bio-TEM分析提供了细菌定位于肿瘤细胞内的直接视觉证据。

**TRIB对肿瘤细胞迁移和转移定植的影响**：建立胞内感染模型（将S. aureus接种至4T1细胞），划痕实验显示S. aureus感染的4T1细胞48 h时划痕区域几乎闭合，而未处理组仍存在明显间隙，定量分析证实迁移率约为未处理组的2倍。Transwell迁移实验进一步验证了该促进作用，穿膜细胞数从约130增至260。体内实验性肺转移模型显示，注射S. aureus感染的4T1细胞的小鼠肺部转移结节数约为对照组的3倍，提供了胞内菌增强CTCs血流中机械耐受性和后续组织定植能力的直接功能证据。

**FS NSs的合成与表征**：FS NSs通过水热法合成并经氨基-聚乙二醇修饰。PEG修饰显著改善了FS NSs的胶体分散性，未修饰FS分散液静置4 h后出现明显沉降，而FS-PEG分散液保持稳定均匀，PEG化FS NSs的PDI为0.167 ± 0.036，显著低于未修饰FS NSs的0.492 ± 0.035。SEM和TEM显示FS NSs具有二维层状结构，元素映射显示Fe和Se均匀分布。XRD图谱与正交晶系FeSe₂标准卡片（PDF#21-0423）一致。Raman光谱在215.65 cm^?1和280.64 cm^?1处显示归属于Se₂单元伸缩模式的显著峰，380.81 cm^?1处的峰归因于二维纳米片结构丰富的表面活性反应位点。XPS分析显示Fe 2p_3/2和Fe 2p_1/2峰分别位于710.38 eV和723.39 eV，自旋能量分离约13.01 eV，为Fe²⁺特征；Se 3d谱峰与Se 3d_5/2和Se 3d_3/2自旋轨道分裂峰匹配。XANES分析确认Fe²⁺氧化态占主导，EXAFS傅里叶变换谱在约2.06 ?处显示归属于Fe–Se配位的显著峰，小波变换分析确认Fe-Se主导结构与外围Fe-O键共存。

**FS NSs的ROS催化性能与机制**：UV-vis光谱结合Tauc图确定FS NSs光学带隙为1.12 eV，窄带隙使超声触发下电子-空穴对分离变得容易。DFT计算DOS显示计算带隙约1.13 eV，与实验测定带隙一致。超声辐照下，FS NSs高效分离的电子-空穴对与吸附氧分子发生氧化还原反应生成单线态氧（¹O₂），同时铁物种参与Fenton反应实现循环反应并连续消耗GSH。DPBF检测显示超声触发FS NSs生成的¹O₂随时间将DPBF氧化为无色产物，而无FS NSs时DPBF吸光度几乎不降低。EPR光谱在FS + H₂O₂组显示强度比1:2:2:1的特征四重信号，为Fenton反应机制形成·OH提供了确凿证据。TMB显色实验进一步证实·OH生成呈FS NSs浓度依赖性。GSH消耗实验显示在模拟细胞内pH微环境溶液中，GSH消耗呈FS NSs浓度依赖性响应。

**MFS NSs的合成、表征与生物相容性**：TEM图像清晰显示CCMs成功包覆于纳米片表面，元素映射显示CCMs主要元素（N、P）在MFS NSs中的额外分布。SDS-PAGE蛋白分析显示MFS NSs具有与4T1 CCMs一致的独特蛋白条带，确认膜包覆过程有效。MFS NSs zeta电位为?12.3 ± 0.21 mV，适度负电荷有利于体内应用。血液学分析和H&E组织病理学检查表明MFS NSs具有良好的生物相容性和无毒性特征。

**MFS体外细胞摄取、氧化应激诱导和细胞毒性评价**：CLSM和FCM分析显示MFS组4T1细胞核周围出现更显著的荧光信号，MFS NSs对同源4T1癌细胞具有特异性结合能力，10 h后摄取效率接近100%，约为FS组的2倍。DCFH-DA探针检测显示MFS + US组4T1细胞内ROS水平显著升高。Calcein-AM/PI双染和CCK-8实验一致证实MFS NSs联合超声是高效的肿瘤治疗平台。

**MFS诱导铁死亡的体外评价**：MFS NSs在肿瘤细胞酸性微环境中响应性释放Fe²⁺，通过Fenton反应氧化为Fe³⁺并产生ROS，Fe³⁺可被GSH还原回Fe²⁺再次参与Fenton反应，同时消耗GSH实现铁死亡。亚铁离子检测显示MFS NSs处理后细胞内Fe²⁺含量显著积累。GSH水平在FS NSs处理后下降，MFS NSs处理后更为显著，联合超声辐照时GSH降幅最大。GPX4活性呈类似趋势，MFS NSs + US组最低。Western blot显示MFS NSs + US组GPX4表达下调最显著。C11-BODIPY^581/591探针和MDA检测显示MFS NSs + US组脂质过氧化水平显著增强。JC-1检测显示MFS + US组线粒体膜电位降幅最大。TEM显示MFS + US组线粒体体积显著缩小、双层膜密度增高、嵴数量减少，符合铁死亡诱导的线粒体功能障碍特征。铁死亡抑制剂（EDTA、ferrostatin-1、GSH、维生素E）显著降低MFS + US诱导的细胞毒性，凋亡抑制剂Z-VAD-FMK部分减弱细胞毒性，而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和坏死抑制剂necrostatin-1对细胞活力无显著影响，证实铁死亡的治疗贡献。

**MFS对肿瘤细胞内细菌的抗菌活性**：CLSM共定位显示DiI标记的MFS NSs在胞质中呈点状分布，部分绿色荧光S. aureus被红色MFS信号包围或邻近，表明MFS NSs被肿瘤细胞内化后可直接接触胞内菌。平板涂布法显示MFS + US组菌落数显著减少。FCM分析显示FS NSs和MFS NSs处理后胞内细菌载量分别降至54.2%和45.8%，联合超声后FS + US组降至16.8%，MFS + US组几乎完全根除胞内菌，细菌载量降至4.89%。CLSM和TEM进一步证实MFS + US组胞内S. aureus显著减少并伴有结构损伤。

**体外免疫应答激活**：铁死亡细胞释放DAMPs（包括钙网蛋白CRT转位和HMGB-1分泌）刺激抗肿瘤免疫应答。MFS + US组CRT暴露和HMGB-1核释放最为显著。DCs与处理后4T1细胞共孵育后，MFS + US组DCs呈现最成熟的形态特征（不规则形状和树突样突起）。FCM分析显示MFS + US组CD80和CD86表达水平显著升高，TNF-α和IL-6分泌浓度最高。为探究细菌来源PAMPs的贡献，S. aureus + MFS + US组DCs成熟度为23.6%，高于未处理对照组（16.1%），证实PAMPs单独即可激活DCs；4T1 + MFS + US组DCs成熟度更强（33.7%），证实DAMPs为主导激活信号；S. aureus感染的4T1细胞经抗生素清除TRIB后DCs成熟度显著降低（40.6%），远低于未经抗生素处理的S. aureus感染4T1 + MFS + US组（54.6%），接近DAMPs单独水平，表明细菌引入在肿瘤细胞死亡来源DAMPs之外对DCs成熟提供了显著额外贡献。

**MFS NSs的体内生物分布**：PA成像显示MFS NSs在680–790 nm波长范围具有显著PA成像能力，715 nm激发波长处PA强度峰值，PA信号强度与MFS NSs浓度呈良好线性关系。体内PA成像显示MFS NSs组肿瘤区域PA信号强度显著高于FS NSs组，注射后8 h FS NSs组肿瘤组织PA信号强度峰值为0.377 ± 0.097，MFS NSs组显著更高，为0.582 ± 0.026。荧光成像显示Cy5.5-MFS NSs组肿瘤区域荧光信号显著强于Cy5.5-FS NSs组，注射后8 h达最大强度。冷冻切片分析显示DiR-MFS NSs在肿瘤组织内荧光信号强度显著高于DiR-FS NSs。

**体内抗肿瘤效率**：4T1荷瘤小鼠随机分为6组：对照、US、FS、MFS、FS + US、MFS + US。肿瘤生长监测显示对照组和US组第20天平均体积分别达670.60 mm³和619.99 mm³，FS组为486.97 mm³，MFS组和FS + US组分别为246.79 mm³和253.41 mm³，MFS + US组平均体积降至63.97 mm³。MFS + US组第20天平均肿瘤重量较对照组、US组、FS组、MFS组和FS + US组分别降低约13.34、10.78、5.53、3.73和4.13倍。免疫荧光显示MFS + US组CD4和CD8阳性染色荧光强度最高，TUNEL阳性绿色荧光最高，PCNA阳性红色荧光最低。治疗期间未观察到体重下降。

**消除TRIB增强肿瘤生长和转移抑制**：16S rRNA FISH显示对照组肿瘤切片中存在大量16S rRNA阳性荧光，而MFS + US组几乎无荧光。Bio-TEM显示大多数细菌样结构主要位于肿瘤细胞胞质内，数量与16S rRNA FISH结果一致。肺转移评价显示MFS + US组肺转移发生率极低，对照组肺转移结节数高出治疗组8.5倍。H&E染色显示对照组肺实质内广泛肿瘤病理，而MFS + US组几乎无异常。

**全身抗肿瘤免疫激活**：FCM分析显示MFS + US组肿瘤组织、前哨淋巴结（SLN）和脾组织中成熟DCs（CD11c⁺CD80⁺CD86⁺）比例最高，分别为59.62 ± 3.82%、67.06 ± 0.86%和48.30 ± 0.60%。MFS + US组血清中TNF-α和IL-6分泌水平最高。肿瘤组织中CTLs（CD3⁺CD8⁺）和CD4⁺辅助T淋巴细胞浸润率分别为23.62 ± 0.83%和30.16 ± 1.18%，均为最高。脾组织中CTLs和CD4⁺辅助T淋巴细胞比例较对照组分别升高5.19倍和3.53倍。血清IFN-γ水平显著升高。记忆T淋巴细胞分析显示MFS + US组显著促进CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺区室中记忆T淋巴细胞分化，Tcm细胞比例分别从8.96%升至19.5%和从11.5%升至20.3%，Tem细胞比例分别从2.36%升至5.49%和从2.62%升至5.46%。RNA-seq的GO富集分析显示DEGs富集于抗原加工与呈递、DCs成熟、T淋巴细胞活化和免疫应答相关生物学过程。

**讨论与结论**

近期研究通过聚焦TRIB作为肿瘤组织关键组分，挑战了肿瘤环境无菌的长期假设，为癌症研究提供了新视角。TRIB已在多种癌症类型中被鉴定，并参与促进肿瘤细胞增殖、增强侵袭性和促进免疫逃逸。值得注意的是，有说服力的证据表明TRIB在调控CTCs细胞骨架动力学中发挥关键作用，从而增强其耐受性和定植潜力。因此，微生物感染的肿瘤细胞在肿瘤患者中的意义可能显著超出目前认知，强调TRIB在癌变过程和治疗干预中的深远临床意义。

据此，研究人员充分利用肿瘤细胞和胞内菌对ROS的易感性，设计了肿瘤-细菌双杀免疫治疗策略，突显了TRIB在癌症进展中的关键作用，为抗肿瘤研究提供了新视角和方向。此外，采用CCM包覆技术伪装声敏剂不仅赋予纳米系统成像功能，还增强了其生物相容性，促进影像引导的靶向治疗。SDT和CDT的协同应用显著放大了对肿瘤细胞和TRIB的破坏，同时触发强效全身免疫应答，实现原发肿瘤的广泛抑制和远处转移发生率的显著降低。

与既往通常采用不同药理剂靶向肿瘤细胞和瘤内细菌的策略不同，该平台通过共享的ROS介导机制整合这些效应。以SDT/CDT生成的ROS作为共同触发因素，系统同时诱导铁死亡性细胞死亡和细菌裂解，确保肿瘤相关抗原和细菌PAMP在肿瘤微环境内释放的时间一致性。关键的是，该过程由超声时间调控，允许这些事件的按需同步化。这种协调创造了高度免疫原性的微环境，相较于细胞毒性和杀菌效应时间常分离的被动给药具有明显优势。传统基于抗生素消除TRIB的方法（如全身广谱抗生素给药）常存在肿瘤穿透性差、脱靶破坏共生微生物群和多药耐药性日益普遍等问题，而该策略通过ROS介导的氧化损伤物理性根除瘤内细菌而不诱导耐药性。与既往报道的SDT或CDT单一疗法（其疗效常受限于ROS生成不足和肿瘤微环境缺氧相关抵抗）相比，本研究的SDT/CDT协同系统实现了显著放大的ROS产量和更优的抗肿瘤效果。此外，与采用工程化活菌的细菌抗肿瘤疗法（存在不受控增殖和全身感染的固有风险）不同，该CCM伪装纳米系统表现出良好的生物安全性和简化的制备流程。值得注意的是，大多数报道的纳米药物仅靶向肿瘤细胞而保留TRIB完整，从而使残留细菌促进复发和转移，而该"一石二鸟"策略同时消除肿瘤细胞和TRIB，这可能解释了本研究中观察到的远处转移的显著抑制。

尽管如此，该策略仍存在若干局限性。首先，本研究建立的胞内感染模型为原理验证系统，其中4T1细胞以高感染复数急性感染S. aureus，这种急性感染可能无法完全重现乳腺癌中鉴定的低丰度、肿瘤适应性胞内微生物群的特征，未来需采用患者来源胞内菌或无菌动物模型验证研究发现的生理相关性。其次，尽管CCM包覆赋予同源靶向能力，但患者间肿瘤相关抗原的异质性可能影响该靶向策略的普适性，临床转化可能需要个性化膜来源或杂合膜工程。第三，SDT的治疗效果本质上依赖于超声的穿透深度和能量沉积，可能限制其应用于深部或形状不规则的肿瘤。第四，该纳米系统的长期生物安全性、生物降解行为和潜在免疫原性尚未在本研究中充分评价，需在大动物模型中进行长期药代动力学和毒性评估。此外，TRIB在不同肿瘤类型中的精确组成和功能异质性仍有待系统表征，可能影响该策略对其他恶性肿瘤的普适性。尽管存在这些局限，本研究强调了瘤内微生物群作为治疗干预新靶点的重要性，为乳腺癌临床治疗提供了创新方法和见解。通过将影像引导靶向、SDT/CDT协同治疗和全身免疫激活整合于单一纳米平台，本研究为同时根除肿瘤细胞和TRIB提供了一种安全、广谱且操作简化的范式，预期所提出的治疗策略将启发各种类型癌症治疗模式开发的进一步研究和进展。

研究结论翻译：肿瘤内驻留胞内菌（TRIB）在三阴性乳腺癌（TNBC）中普遍存在，作为肿瘤病理微环境的组成部分，通过调控细胞增殖、代谢及免疫抑制加速TNBC进展，并通过细胞骨架重排增强循环肿瘤细胞对机械应力的抵抗能力，促进肿瘤转移并阻碍临床治疗。本研究开发了一种先进的靶向TRIB治疗策略，通过消除肿瘤细胞和胞内菌、重塑肿瘤免疫及抑制转移定植来阻断TNBC进展。研究人员制备了癌细胞膜修饰的窄带隙FeSe₂纳米片，用于增强超声触发的ROS生成及影像引导精准治疗。该纳米平台利用内源性H₂O₂和GSH放大化学动力学效应，诱导肿瘤细胞严重氧化应激和铁死亡。DAMPs和PAMPs联合有效激活DCs并启动强效抗原特异性T细胞免疫应答。本研究通过干预肿瘤内微生物群，为临床转移性乳腺癌治疗提供了替代且有前景的策略。