结直肠癌中成纤维细胞LeprnegMmphigh状态转变：协同TNFα与TGFβ信号通过Tcf21-Lepr轴上调Csf3募集巨噬细胞促进结直肠癌进展

《Advanced Science》：Loss of Lepr in Fibroblasts Drives Tumor Development by Promoting Macrophage Infiltration

癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）是结直肠癌（colorectal cancer, CRC）进展的关键调控者，但其功能可塑性及状态转变的调控机制仍未完全阐明。本研究揭示了一种由肿瘤驱动的CRC成纤维细胞状态转变，其特征为瘦素受体（leptin receptor, Lepr）表达丢失并获得促炎特征。研究人员证明，协同肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α, TNFα）和转化生长因子β（transforming growth factor-β, TGFβ）信号驱动了该重编程，并伴随Tcf21-Lepr调控轴的抑制。经历该转变的成纤维细胞获得了促进巨噬细胞募集并加速肿瘤发展的能力。成纤维细胞中Lepr或Tcf21的缺失会上调集落刺激因子3（colony stimulating factor 3, Csf3），进而增强重编程成纤维细胞的巨噬细胞募集能力。一致地，阻断TNFα与TGFβ信号可破坏成纤维细胞重编程并减弱巨噬细胞浸润。综上，本研究结果揭示了炎症信号如何重塑基质细胞状态以促进巨噬细胞积累，最终形成加速CRC进展的促肿瘤生态位。

结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球癌症相关发病与死亡的主要原因之一。除恶性上皮细胞外，肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）作为由基质、免疫及血管组分构成的复杂生态系统，对肿瘤生长、免疫逃逸及治疗反应具有决定性影响。癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）是TME中占主导且高度可塑的基质群体，其通过分泌生长因子、重塑细胞外基质（extracellular matrix, ECM）及调控免疫细胞的募集与激活深刻影响CRC生物学行为。尽管单细胞转录组研究已揭示CAFs可分化为促纤维化肌成纤维细胞性CAFs（myofibroblastic CAFs, myCAFs）和促炎CAFs（inflammatory CAFs, iCAFs）等功能亚群，但驱动这些不同成纤维细胞状态之间动态转变的分子机制、内在调控回路及外在信号组合仍未完全明确。瘦素受体（leptin receptor, Lepr）阳性的成纤维细胞广泛分布于骨髓、血管及肠上皮等多种组织中，在维持组织稳态中发挥重要作用。前期研究表明，肠道Lepr⁺成纤维细胞可通过基质胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor 1, IGF1）-上皮IGF1受体（IGF1R）轴维持肠干/祖细胞群体并促进上皮修复。然而，Lepr⁺成纤维细胞是否参与CRC进展、Lepr信号是否在TME中调控成纤维细胞功能状态，长期以来缺乏深入研究。

发表在《Advanced Science》的这项研究中，研究人员围绕“肿瘤如何驱动成纤维细胞功能状态转变并促进免疫抑制微环境形成”这一核心科学问题展开系统探索。研究人员利用AOM/DSS诱导的结肠肿瘤小鼠模型（Lepr-Cre;mTmG谱系示踪模型），结合液滴式3′单细胞RNA测序（droplet-based 3′ single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）技术，首次鉴定出Lepr-lineage来源的Lepr_negMmphigh细胞亚群在结肠肿瘤中显著富集。通过体内外功能实验、条件培养基共培养体系、基因敲除小鼠模型、空间转录组学及分子生物学手段，研究人员系统阐明了TNFα与TGFβ协同信号通过抑制Tcf21-Lepr调控轴驱动成纤维细胞向促炎状态重编程的分子机制，揭示了Lepr或Tcf21缺失通过上调Csf3增强巨噬细胞募集并加速肿瘤发展的新范式。该研究的重要意义在于突破了以往将CAFs视为静态或均一群体的认知局限，阐明了炎症信号整合重塑基质细胞身份、构建促肿瘤生态位的动态过程，为针对基质-免疫互作的CRC治疗策略提供了新靶点。

在开展本研究过程中，研究人员综合运用了多项关键技术方法。研究队列包括AOM/DSS诱导的Lepr-Cre;mTmG小鼠、Pdgfra-CreERT2;Lepr^fl/fl及Pdgfra-CreERT2;Tcf21^fl/fl条件性基因敲除小鼠，以及来源于郑州大学第一附属医院的CRC患者临床组织样本。核心技术涵盖10× Genomics液滴式3′scRNA-seq、Bulk RNA-seq、基于PHATE与scEpath的伪时序轨迹分析、PROGENy信号通路推断、CellChat细胞通讯分析、Xenium空间转录组测序、RNAscope原位杂交、CUT&RUN-qPCR、双荧光素酶报告基因实验、Transwell迁移实验及流式细胞术分选等。

2.1 Lepr-Lineage-Derived LeprnegMmphigh Cells Are Enriched in Colon Tumors

研究人员在8周龄Lepr-Cre;mTmG小鼠中建立AOM/DSS诱导的结肠肿瘤模型，通过GFP标记Lepr-lineage细胞并进行scRNA-seq分析。结果显示，Lepr-lineage来源细胞在CRC进展过程中比例显著升高，约占肿瘤中Col1a1⁺基质细胞的40%。进一步对GFP⁺成纤维细胞进行亚群分析，鉴定出四个转录状态各异的亚群（Fb1–Fb4）。其中Fb1和Fb2主要存在于正常组织，而Fb3和Fb4特异性富集于肿瘤。Fb4亚群表现出显著的炎症相关基因（如Mmp3、Mmp13、Cxcl5、Il11、Il1rl1和Inhba）高表达，同时Lepr表达显著降低，研究人员将其定义为Lepr_negMmphigh细胞。该亚群在伤口愈合、糖酵解、ECM降解及炎症反应等通路中表现出最高的基因集评分活性。跨物种分析显示，人CRC单细胞数据中存在对应的hFb4亚群，该亚群特异性富集于CMS4型结直肠癌，且在CRC癌组织中高表达MMP3和IL11，而在正常组织中罕见。

2.2 Combined TNFα and TGFβ Promotes Lepr-Lineage Fibroblast Reprogramming toward the LeprnegMmphigh State

通过伪时序轨迹分析，研究人员将成纤维细胞亚群按照Fb1→Fb2→Fb3→Lepr_negMmphigh的顺序进行排列，发现Lepr表达沿伪时间逐渐降低。PROGENy通路活性推断显示，TNFα与TGFβ通路活性在该轨迹中显著上调。体外实验证实，仅当TNFα与TGFβ联合处理正常结肠来源的Lepr⁺成纤维细胞时，才能显著诱导Mmp3、Cxcl5、Saa3、Il1rl1、Il11和Inhba等基因表达，并伴随Lepr表达下调；单独刺激任一因子均无法重现该效应。Bulk RNA-seq进一步证实，联合处理导致Fb1/Fb2相关标志物下调，而Lepr_negMmphigh特征性基因显著上调。细胞通讯分析提示，肿瘤微环境中髓系细胞（尤其是巨噬细胞和中性粒细胞）是TNFα的主要来源，而TGFβ由巨噬细胞及T细胞等多类细胞产生，这些发现共同支持TNFα与TGFβ协同驱动成纤维细胞重编程的模型。

2.3 LeprnegMmphigh Cells Promotes Tumor Development by Promoting Macrophage Infiltration

研究人员将从Lepr-Cre;mTmG小鼠中分离的GFP⁺成纤维细胞经TNFα和TGFβ预处理后，与MC38结肠腺癌细胞共同原位注射至C57BL/6J小鼠盲肠浆膜下层。结果显示，经联合细胞因子处理的成纤维细胞显著促进肿瘤生长，且转录组分析表明这些肿瘤表现出CMS4相关基因特征模块评分升高。CellChat分析及人CRC scRNA-seq数据均提示hFb4成纤维细胞与巨噬细胞的配受体互作强度最高。Transwell实验证实，经TNFα和TGFβ处理的成纤维细胞条件培养基可显著增强骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDM）的迁移能力。在AOM/DSS模型中，系统性给予TNFα和TGFβ抑制剂可显著减少肿瘤内Lepr_negMmphigh细胞数量并减弱巨噬细胞浸润。此外，Xenium空间转录组分析显示，ST-Fib4成纤维细胞与巨噬细胞在CRC组织内频繁共定位，且空间生态位分析表明ST-Fib4高表达区域伴随炎症相关的Macro_C3巨噬细胞亚群显著富集，从空间维度证实了二者的互作关系。

2.4 Loss of Lepr Contributes to the Promoting Effects of LeprnegMmphigh Cell-Induced Macrophage Infiltration via Upregulation of Csf3

为探究Lepr丢失的功能意义，研究人员构建了成纤维细胞特异性Lepr条件性敲除小鼠（Pdgfra-CreERT2;Lepr^fl/fl, Leprcko）。在AOM/DSS诱导的肿瘤模型中，Lepr缺失显著增加了肿瘤数量和大小，并伴随肿瘤内巨噬细胞数量与比例显著上升。体外实验中，敲低Lepr的成纤维细胞条件培养基显著增强巨噬细胞迁移，而联合敲低Csf3可逆转该效应。ELISA显示Lepr敲低及TNFα/TGFβ联合处理均显著增加成纤维细胞G-CSF（granulocyte colony-stimulating factor）分泌；Western blot证实Leprcko小鼠肿瘤中G-CSF蛋白水平升高。在Leprcko小鼠中使用氯膦酸脂质体（clodronate liposomes）清除巨噬细胞后，Lepr缺失导致的肿瘤增大被显著逆转。人CRC数据库分析显示，CSF3在CMS4型肿瘤中显著高表达，且高表达与患者不良预后相关。

2.5 The Loss of Lepr in LeprnegMmphigh Cells are Caused by TNFα and TGFβ-Induced Tcf21 Downregulation

通过筛选单细胞数据中下调的转录因子，研究人员锁定basic helix-loop-helix（bHLH）转录因子Tcf21在Lepr_negMmphigh细胞及人hFb4细胞中均显著下调。Tcf21表达与Lepr表达呈正相关。敲低Tcf21可降低GFP⁺成纤维细胞中Lepr表达并上调Csf3。生物信息学分析预测Lepr基因转录起始位点上游2 kb区域存在两个Tcf21结合位点，双荧光素酶报告实验证实Tcf21可直接结合并激活Lepr启动子；CUT&RUN-qPCR进一步验证了Tcf21在Lepr启动子区的显著富集。体内实验中，成纤维细胞特异性Tcf21敲除小鼠（Pdgfra-CreERT2;Tcf21^fl/fl, Tcf21cko）表现出与Leprcko小鼠一致的表型，即肿瘤数量增加、F4/80⁺巨噬细胞浸润增多。TNFα与TGFβ联合处理可在体外显著下调Tcf21表达，提示该调控轴是连接炎症信号与成纤维细胞身份丢失的关键环节。

讨论部分：本研究表明，肿瘤相关Lepr_negMmphigh促炎成纤维细胞状态并非由肿瘤预先存在的谱系决定，而是由常驻成纤维细胞响应肿瘤源性炎症信号动态获得。该转变由TME中TNFα和TGFβ的整合信号驱动，通过破坏Tcf21-Lepr依赖的调控程序而实现，该程序通常在生理状态下约束成纤维细胞过度激活。既往研究多聚焦于单一细胞因子（如TGFβ单独促进myCAF分化），而本研究揭示了组合性信号输入（TNFα叠加TGFβ）可重新定向Lepr⁺成纤维细胞的命运轨迹，使其偏向促炎和免疫调节表型。Tcf21-Lepr轴作为维持成纤维细胞静息/稳态身份的内在调控模块，在心脏、肾脏、骨髓及脂肪组织等多种器官的基质细胞中均有重要作用；本研究首次在CRC中证实该轴可直接调控Lepr转录，并发现Tcf21功能缺失可在功能上模拟Lepr丢失的部分效应。在功能层面，Csf3是Lepr_negMmphigh状态的关键转录输出，其表达具有细胞状态特异性，而非肿瘤相关炎症的普遍标志；研究证实Csf3是连接成纤维细胞状态转变与巨噬细胞积累的功能介质。尽管作者在局限性中指出TNFα/TGFβ诱导Tcf21下调的具体分子机制（如Smad2/3和NF-κB是否直接抑制Tcf21启动子或重塑染色质可及性）尚待阐明，且Csf3下游信号通路及体内直接因果关系仍需进一步研究，但本研究整体建立了“炎症信号整合—Tcf21-Lepr程序失稳—Csf3表达—巨噬细胞募集—促肿瘤生态位形成”的完整逻辑链条，为通过靶向基质细胞身份转换或干预Csf3/巨噬细胞轴来治疗CRC提供了理论依据。

研究结论：本研究表明，在结直肠癌进展过程中，稳态Lepr⁺成纤维细胞发生由肿瘤驱动的状态转变，丧失原有身份并获得促炎及免疫调节功能。该转变由肿瘤微环境中TNFα和TGFβ信号的整合所驱动，并伴随Tcf21-Lepr调控程序的破坏。功能上，这一转变使成纤维细胞通过状态限制性的CSF3产生重塑肿瘤免疫微环境，促进巨噬细胞积累并加速肿瘤发展。这些结果提示，靶向炎症信号及成纤维细胞身份程序可能成为调控CRC中基质-免疫互作的潜在治疗切入点。