《Journal of Dermatological Science》：Cornified envelope-related gene expression is epigenetically regulated by TET in basal keratinocytes of epidermis
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摘要专业翻译
皮肤由表皮、真皮和皮下组织三层结构组成。持续暴露于外部环境的表皮保护机体免受水分流失、病原体、紫外线（UV）辐射及其他外部刺激的侵害。表皮包含多种细胞类型，包括角质形成细胞和黑素细胞，其中角质形成细胞在整个组织中形成复层结构。与真皮相邻的基底细胞
摘要专业翻译
皮肤由表皮、真皮和皮下组织三层结构组成。持续暴露于外部环境的表皮保护机体免受水分流失、病原体、紫外线（UV）辐射及其他外部刺激的侵害。表皮包含多种细胞类型，包括角质形成细胞和黑素细胞，其中角质形成细胞在整个组织中形成复层结构。与真皮相邻的基底细胞增殖并进行终末分化。这些细胞通过蛋白质合成和交联分化为棘层、颗粒层和角质层。角质包膜（CE）是在表皮上层（特别是角质层）终末分化的角质形成细胞中形成的特化蛋白质-脂质结构，通过交联丝聚蛋白（FLG）、兜甲蛋白（LOR）等结构蛋白以及其他CE相关蛋白（包括毛透明蛋白（TCHH）和角化素（CNFN））而生成。表皮分化被认为受包括DNA甲基化在内的表观遗传机制调控，但具体细节尚不清楚。
DNA甲基化调控基因表达。DNA去甲基化始于十-十一易位（TET）酶将5-甲基胞嘧啶（5-mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC）。TET激活需要2-酮戊二酸、亚铁离子（Fe2?）和维生素C（VC）。VC作为TET的辅因子，参与基因表达的表观遗传调控。
VC是一种必需营养素，在皮肤中发挥多种生理作用。研究人员先前已证明VC促进胶原蛋白合成、减少UV辐射诱导的表皮损伤并抑制黑色素沉积。此外，研究人员报道，在缺乏VC生物合成能力的小鼠模型中，VC缺乏导致表皮萎缩。并且，利用再现表皮结构的三维（3D）人表皮等效模型，研究人员观察到VC通过促进增殖相关基因的DNA去甲基化来增强角质形成细胞增殖并增加表皮厚度。然而，基底单层角质形成细胞及其他细胞系中的表观遗传调控仍有待探索。
在本研究中，研究人员以VC作为TET活性调节剂，研究了基底角质形成细胞中TET介导的表观遗传调控。研究人员使用新生大鼠角质形成细胞（NRKs）——其在培养过程中会发生分层和分化——来检验VC依赖性TET活性调节是否与5-hmC水平变化及参与表皮角化的基因表达相关。
论文解读文章
一、研究背景与目的
皮肤作为机体与外环境之间的第一道屏障，由表皮、真皮和皮下组织构成。表皮持续暴露于外界，保护机体免受水分流失、病原体、紫外线辐射等侵害。表皮中的角质形成细胞从基底层出发，经过棘层、颗粒层，最终在角质层形成特化的蛋白质-脂质结构——角质包膜（CE）。CE通过交联丝聚蛋白（FLG）、兜甲蛋白（LOR）以及毛透明蛋白（TCHH）、角化素（CNFN）等CE相关蛋白而构建，是表皮屏障功能的重要结构基础。尽管表皮分化被认为受到包括DNA甲基化在内的表观遗传机制调控，但具体细节此前尚不清楚。
DNA去甲基化始于十-十一易位（TET）酶将5-甲基胞嘧啶（5-mC）氧化为5-羟甲基胞嘧啶（5-hmC），该过程需要2-酮戊二酸、亚铁离子（Fe2?）以及维生素C（VC）作为辅因子。VC在皮肤中具有多重生理功能，已有研究表明其可促进胶原合成、减轻紫外线损伤、抑制黑色素沉积，并在3D人表皮等效模型中通过促进增殖相关基因的DNA去甲基化增强角质形成细胞增殖和表皮厚度。然而，VC对基底单层角质形成细胞中TET介导的表观遗传调控及其与表皮角化基因表达的关系尚未得到系统研究。为此，本研究以新生大鼠角质形成细胞（NRKs）为模型，探讨VC依赖性TET活性调节是否与5-hmC水平变化及表皮角化相关基因表达相关联。
二、研究内容与主要结论
研究人员通过一系列体外实验，系统评估了VC对NRKs中TET活性、DNA羟甲基化水平以及CE相关基因和蛋白表达的影响。主要发现包括：VC在100 μM浓度以下无细胞毒性且能被细胞有效摄取；VC处理可显著提高NRKs中全球5-hmC水平，且该效应依赖于TET2/TET3活性；TET2/3敲低可显著降低CE相关基因（Tchh、Lor、Cnfn，Flg呈下降趋势）的表达；在NRKs长达11天的分化培养中，VC处理显著上调Flg、Tchh、Lor、Cnfn的mRNA水平及FLG、TCHH、CNFN的蛋白水平，同时促进分化标志基因Krt1和Krt10的表达。这些结果提示VC可能通过TET依赖的DNA羟甲基化调控参与表皮角质形成细胞的分化与角化过程。
三、关键技术与方法
本研究主要采用了以下核心技术方法：新生大鼠角质形成细胞（NRKs）原代培养体系（由Dr. Baden建立并提供）；WST-8细胞活力检测与LDH细胞毒性检测；高效液相色谱（HPLC）结合电化学检测测定细胞内VC浓度；DNA斑点印迹（dot blot）分析全球5-mC和5-hmC水平；免疫荧光染色观察5-hmC的细胞分布；小干扰RNA（siRNA）介导的Tet2和Tet3基因沉默；逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测基因mRNA表达；DNA微阵列（Clariom? S Assay，大鼠）进行全转录组表达分析并结合Gene Ontology（GO）富集分析；Western blotting检测FLG、TCHH、LOR、CNFN蛋白水平。
四、研究结果
3.1 VC对NRKs的细胞毒性及细胞内摄取
通过WST-8和LDH检测发现，100 μM VC显著提高细胞活力，而500 μM VC降低细胞活力；250和500 μM VC显著增加LDH释放，提示高浓度VC具有细胞毒性。HPLC分析显示，细胞内VC水平呈浓度依赖性升高，25 μM处理1小时、50或100 μM处理3小时达到峰值，且24小时内基本耗竭，因此实验中每日更换含VC培养基。
3.2 VC提高全球5-hmC水平
DNA斑点印迹分析显示，50和100 μM VC处理12或24小时不改变5-mC水平，但显著提高5-hmC水平。免疫荧光染色进一步证实VC处理组细胞中5-hmC荧光强度明显增强。
3.3 VC通过TET提高5-hmC水平
由于NRKs中Tet1表达可忽略，研究聚焦于Tet2和Tet3。siRNA介导的Tet2/3敲低后，VC诱导的5-hmC升高效应被显著抑制，表明VC提高5-hmC水平依赖于TET2/3活性。
3.4 鉴定VC通过TET调控的基因
DNA微阵列分析显示，siTet2/3+VC组与阴性对照+VC组相比有1,252个基因表达变化≥2倍。GO富集分析发现，TET2/3敲低后下调基因显著富集于“CE”条目。RT-qPCR验证表明，TET2/3敲低显著降低Tchh、Lor、Cnfn表达，Flg呈下降趋势，确认CE相关基因为TET依赖性VC调控靶基因。
3.5 VC影响NRKs培养过程中CE相关基因表达
在11天分化培养中，VC处理组第1天Tet2和Tet3 mRNA水平显著低于对照组，而Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b无显著差异。CE相关基因方面，VC组Flg在第7天、Tchh在第11天、Lor在第11天mRNA水平显著升高，Cnfn在第4和第7天显著升高；蛋白水平上，FLG在第7天、TCHH在第4天、CNFN在第11天显著高于对照组，LOR蛋白无显著差异但随培养时间逐渐增加。此外，VC组Krt5在第4和第11天显著升高，Krt1和Krt10在所有检测时间点均显著升高，而Krt14无显著变化。
五、讨论与结论
讨论部分指出，VC在中等浓度下增强细胞活力而高浓度产生细胞毒性，可能与大剂量VC诱导自由基产生和pH降低有关。VC显著提高5-hmC水平且该效应依赖TET2/3，与胚胎干细胞、成骨细胞、成肌细胞及3D表皮模型中的发现一致，首次在基底单层角质形成细胞中证实。DNA微阵列结合GO分析锁定CE相关基因为VC-TET轴的关键靶点。培养过程中Tet和Dnmt亚型在分化前（第1天）高表达，提示基底层角质形成细胞可能受到更强的表观遗传调控。VC对CE相关基因和蛋白的上调作用在分化后期（第4天及以后）显现，并伴随Krt1/Krt10分化标志基因上调，表明VC促进表皮分化。本研究首次报道VC对CNFN的调控作用。
研究局限性包括：未进行位点特异性DNA去甲基化分析和体内验证；机制证据主要基于全球5-hmC水平变化、Tet敲低及基因表达变化；仅在NRKs中验证，需在其他模型中进一步确认；未检测50 μM以下VC浓度的影响，无法确定最小有效浓度及生理浓度范围内的效应。
研究结论：VC以TET依赖性方式提高基底角质形成细胞中5-hmC水平，并与角质形成细胞分化过程中CE相关基因表达相关联。这些发现为TET依赖性5-hmC变化与培养角质形成细胞中CE相关基因表达之间的关联提供了证据，提示VC在角质形成细胞分化中具有潜在作用。
