基于PS修饰DNA识别与TMSD信号放大的HClO荧光成像策略用于区分癌细胞与正常细胞

《RSC Advances》：An efficient hypochlorous acid fluorescence imaging strategy based on toehold-mediated strand displacement for distinguishing cancer cells from normal cellsOpen Access

　　

癌症是危害全球公共卫生的最重大疾病之一。早期检测已被证明可显著改善预后并提高治愈率。次氯酸（HClO）是一种关键活性氧（ROS），在癌细胞中常呈现升高水平。在此，研究人员基于立足点介导链置换（TMSD）建立了一种高灵敏、高特异且高效的HClO检测方法。该方法采用由三条单链DNA形成的双链复合物（TN）携带荧光基团（FAM），并引入带有磷硫代（PS）修饰位点的发夹DNA（HP）以特异性识别HClO。在HClO作用下，携带FAM基团的短片段最终从TN中释放，导致体系荧光显著增强。经优化后，该方法获得优异的HClO检测性能，检测范围为0.01–7 μM（检出限（LOD）：12.9 nM）。对自来水、血清和细胞裂解物等实际样品的分析也证实其良好的稳定性和准确性。最重要的是，该方法能够对细胞内HClO进行成像，从而有效区分癌细胞与正常细胞。总体而言，该方法具有检测性能优异、响应时间快、操作简便和材料易得等多种优点，使其在癌症早期诊断中具有应用前景。

癌症是全球高致死性疾病，全球癌症负担在青少年和年轻成人中持续上升，且早期症状常不明确，易导致诊断和治疗延迟；而早期、精确诊断可显著改善预后并提高患者生存率。现有早期癌症筛查技术仍受灵敏度和准确性有限等制约，因此亟需改进或建立新的诊断体系。正常细胞与癌细胞存在显著生化差异，包括氧化应激稳态失调导致活性氧（reactive oxygen species, ROS；一类含氧高反应性分子）异常升高、活性氮（reactive nitrogen species, RNS；一类含氮高反应性分子）如过氧亚硝酸盐积累以及某些酶表达增加，这些特征可作为区分癌细胞的标志物。HClO是生物体内由髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO；催化HClO生成的酶）催化生成的关键ROS，参与免疫防御、氧化应激调节和细胞信号传导；其水平波动反映细胞氧化应激状态，异常升高与炎症、肝损伤、动脉粥样硬化和癌症等病理过程相关。癌细胞中HClO水平常高于正常细胞，并可加剧氧化应激、促进癌细胞增殖和侵袭，因此细胞内HClO的精确检测对癌症早期筛查和减少恶性结局具有重要意义。现有HClO检测主要基于荧光探针技术，已开发近红外、比率型和双功能型探针，但仍存在特异性不足、灵敏度低、响应慢、体内成像稳定性差和分辨率低等局限；核酸探针因可编程性和生物相容性而成为生化分析与生物成像的重要工具，TMSD相较催化发夹组装（CHA）和杂交链式反应（HCR）具有更可控的反应动力学和更灵活的序列设计，故研究人员开展了基于TMSD的HClO荧光成像策略研究。

研究人员构建了由HP、TN和T-B组成的一步循环检测体系。TN由T-A、T-C和T-D三条单链组装，T-A和T-C末端分别标记淬灭基团（BHQ1；黑洞淬灭剂1）和荧光基团（FAM；羧基荧光素）；无HClO时FAM荧光被BHQ1淬灭。HClO存在时，HP上的PS位点被氧化切割，释放活性序列HP′；HP′侵入TN末端立足点I，触发TMSD并置换T-D，暴露立足点II；T-B结合立足点II，形成稳定T-A/T-B双链并释放HP′和T-C，导致体系荧光显著增强；释放的HP′可继续侵入其他TN，实现信号放大。该研究得出该方法具有高灵敏度、高特异性、快速响应和一步操作等结论，并能在实际样品和细胞内成像中区分癌细胞与正常细胞，对癌症早期诊断和生化分析具有应用意义。

关键技术方法：构建由T-A、T-C和T-D组装的三链复合物TN（T-A与T-C末端分别标记BHQ1和FAM）及含PS位点的HP；将HP、TN、T-B与HClO在Tris缓冲液（含MgCl₂）中37 °C孵育20 min，进行一步TMSD循环荧光检测；以20%天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE；非变性凝胶电泳）验证；在自来水、2%稀释人血清和SNU387细胞裂解物中开展回收实验；样本来源包括SNU387肝癌细胞、PC9肺腺癌细胞和LO2正常肝细胞（购自Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd，上海，中国）及人血清（PAN-Biotech，Adenbach，德国）；细胞经探针共孵育、Hoechst 33342染色后荧光显微镜成像，并以N-乙酰半胱氨酸（NAC；ROS清除剂）预处理和CCK-8（细胞增殖/毒性检测试剂）评估。

研究结果：
1. Working principle of the HClO detection strategy（HClO检测策略的工作原理）：通过构建HP、TN和T-B组成的一步循环检测体系，明确HClO氧化切割HP上的PS位点后释放HP′，HP′侵入TN并触发TMSD，T-B协助循环并释放带FAM的短片段，使荧光增强；无HClO时循环不能启动，背景荧光弱，从而可实现HClO定量分析。
2. Feasibility analysis of HClO detection（HClO检测可行性分析）：通过四组反应体系荧光比较和native PAGE表征，发现仅在HP、TN、T-B和HClO同时存在时荧光显著升高；凝胶结果显示TN几乎完全转化为T-A/T-B双链，并出现HP裂解产生的短链，证明该策略可按设计完成反应并具有可行性。
3. Evaluation of the detection performance for HClO（HClO检测性能评估）：通过pH、HP/TN/T-B浓度和反应时间优化及不同浓度HClO检测，确定pH 7.4–9.4时响应满意，最佳条件为HP 50 nM、TN 400 nM、T-B 400 nM、反应20 min；荧光强度与HClO浓度在0.01–7 μM范围内线性相关（R² = 0.995），检出限（LOD；3σ/S法所得最低可检出浓度）为12.9 nM；H₂O₂和O₂^?等干扰物不引起明显荧光，加入HClO后荧光接近单独HClO体系，表明特异性良好；与现有方法比较，该方法灵敏度提高、DNA链合成较简单、一步循环降低系统复杂度并提高检测效率。
4. Detection capability testing in real samples（实际样品检测能力测试）：通过自来水、2%稀释人血清和SNU387细胞裂解物回收实验，测得自来水和细胞裂解物中HClO表观浓度分别为337 nM和798 nM，血清中未检出；三种样品回收率为92.2%–107.8%，表明该方法在实际样品分析中具有良好稳定性和准确性。
5. Intracellular HClO imaging for cancer cells and normal cells distinguishing（细胞内HClO成像用于区分癌细胞与正常细胞）：通过SNU387、PC9和LO2细胞成像，PC9和SNU387细胞荧光信号显著高于LO2细胞，SNU387与PC9之间亦存在差异，原文认为与各自细胞内环境差异有关；NAC预处理后PC9和SNU387细胞内荧光信号显著降低；CCK-8显示探针共孵育未显著影响细胞活力，表明该方法可成像细胞内HClO并区分癌细胞与正常细胞。

讨论部分总结：该研究将PS修饰DNA识别与TMSD信号放大结合，检测性能超过或可比众多现有方法；相较硅罗丹明和香豆素-苯并吡喃鎓酰肼探针，该方法灵敏度提高；DNA链合成相对简单，不同于金纳米颗粒法的复杂制备；一步循环减少检测系统复杂度、提高效率并避免繁琐人工干预。其局限在于适合特定反应时间后的终点检测，终点荧光信号反映HClO水平，不适用于连续、动态监测HClO水平变化；研究涉及的实际样本类型和肿瘤细胞类型有限，仍需更多其他样本验证更广泛适用性；DNA链的可编程性使该策略可用于开发其他靶标检测方法。

研究结论部分翻译：该研究开发了一种HClO响应荧光传感策略，整合PS修饰DNA识别与TMSD信号放大，用于区分癌细胞与正常细胞。检测探针由发夹HP、三链复合物TN和单链T-B组成；HClO存在时HP被特异性切割并释放HP′，HP′侵入TN末端启动循环反应，T-B通过促进循环过程放大信号。该方法具有高灵敏度（LOD为12.9 nM）、高特异性、高效（检测反应仅需20 min）、简便（一步反应）和低成本等优点；回收实验证实其在实际样品中的可靠性和准确性；最重要的是，该检测能够区分癌细胞与正常细胞。鉴于其优异性能，该方法在癌症早期诊断中具有较大应用前景。但该方法适用于特定反应时间后的终点检测，终点荧光信号反映HClO水平，不适用于连续、动态监测HClO水平变化；同时，该研究涉及的实际样本类型和肿瘤细胞类型有限，需进一步评估更多其他样本以验证其更广泛适用性；此外，由于DNA链具有优异可编程性，该检测策略可用于开发其他靶标的检测方法，为生化分析领域提供新思路。总体而言，该工作提出了一种有效且可靠的HClO分析方法，可区分癌细胞与正常细胞，在癌症早期诊断和生化分析中具有较大应用潜力。