《RSC Advances》：A GRPR-targeted near-infrared fluorescent probe for precise tumor imaging and intraoperative surgical navigationOpen Access
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荧光引导手术需要能够提供可靠对比度同时最小化背景干扰的肿瘤成像探针。在此，研究人员通过将铃蟾肽（bombesin，BBN）与IR783荧光团共价偶联，开发了一种靶向胃泌素释放肽受体（gastrin-releasing peptide receptor，GRPR
荧光引导手术需要能够提供可靠对比度同时最小化背景干扰的肿瘤成像探针。在此，研究人员通过将铃蟾肽（bombesin，BBN）与IR783荧光团共价偶联，开发了一种靶向胃泌素释放肽受体（gastrin-releasing peptide receptor，GRPR）的近红外（near-infrared，NIR）荧光探针IR783-BBN。该分子设计旨在结合BBN的肿瘤靶向潜力与IR783的NIR成像能力。研究人员成功合成了IR783-BBN，其最大吸收和发射波长分别为801 nm和820 nm。体外研究表明，在测试条件下，该探针的细胞活力保持在82%以上，并以时间和浓度依赖性方式被4T1乳腺癌细胞内化。在4T1荷瘤小鼠中，全身给药后IR783-BBN产生可检测的肿瘤相关荧光，注射后1小时的肿瘤-肌肉荧光比值为6.97（n=3）。对离体组织的组织学和荧光显微镜分析进一步支持了荧光信号与含肿瘤标本之间的对应关系。总体而言，这些发现支持了IR783-BBN作为一种BBN偶联的NIR荧光探针用于肿瘤成像和荧光引导手术导航的可行性。
研究背景与意义
精准的肿瘤定位和完全切除是实现良好手术预后的核心。术中实时近红外（near-infrared，NIR）荧光导航因其高灵敏度、无电离辐射、实时反馈以及相对改善的组织穿透能力，已成为图像引导手术的重要工具，尤其适用于边界不清且呈浸润性生长的肿瘤，如乳腺癌。然而，当前可用的荧光探针仍面临诸多挑战，包括肿瘤特异性不足、高背景信号、有限的成像对比度以及难以平衡良好的药代动力学特性与生物相容性。因此，开发具有可靠成像性能的肿瘤靶向NIR荧光探针对改善术中肿瘤可视化具有重要意义。
受体介导的靶向策略可通过利用肿瘤细胞表面特定受体的过表达来增强探针在肿瘤部位的蓄积。其中，胃泌素释放肽受体（gastrin-releasing peptide receptor，GRPR）因在多种实体瘤（包括某些乳腺癌亚型）中过表达而备受关注。铃蟾肽（bombesin，BBN）及其类似肽能以高亲和力结合GRPR，已被广泛研究作为肿瘤成像和药物递送的靶向配体。此外，荧光团的选择对于实现高对比度肿瘤成像也至关重要。IR783及其衍生物是一类具有NIR荧光、功能修饰位点和适中亲脂性的七甲川菁染料，是构建肿瘤成像探针的理想骨架。基于此，研究人员设计并合成了一种靶向GRPR的NIR荧光探针IR783-BBN，通过将BBN肽共价偶联至IR783发色团，以期结合BBN介导的肿瘤靶向与IR783的NIR荧光成像能力，并在4T1荷瘤小鼠模型中系统评估其用于肿瘤成像和荧光引导手术导航的性能。
关键技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：通过亲核取代反应将BBN-SH与IR783共价偶联合成探针IR783-BBN，并采用制备型高效液相色谱（preparative HPLC）进行纯化；利用高效液相色谱（HPLC）和质谱（HRMS）对产物进行表征；通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱测定光物理性质；采用标准MTT法评估体外细胞毒性；利用共聚焦显微镜和流式细胞术表征细胞摄取行为；使用实时小动物活体光学成像系统（VISQUE In Vivo Optical Imager，Cy7通道）进行体内荧光成像及离体生物分布分析；在荧光引导下进行序贯性肿瘤切除手术，并通过苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色和组织切片荧光显微成像进行病理验证。所有动物实验均已获得西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准（批号：XJTUAE2024-1061）。
研究结果
3.1 探针的设计、合成与表征：研究人员通过亲核取代反应将BBN肽共价偶联至IR783染料，成功合成了IR783-BBN。HPLC显示主峰保留时间为16.39 min，表明产物纯度较高。LC-MS观察到主导分子离子峰m/z为1152.5370，与预期分子结构一致，证实了探针的成功合成与纯化。
3.2 光物理性质与体外细胞毒性：IR783-BBN在二甲基亚砜（DMSO）中的最大吸收峰位于801 nm，荧光发射峰位于820 nm，均处于NIR窗口。其荧光量子产率为0.314，高于吲哚菁绿（ICG）的0.13。光稳定性评估显示，IR783-BBN的光漂白速率常数为0.08947 min?1，低于ICG的0.1571 min?1，表现出更好的光稳定性。MTT试验表明，在0至50 μM浓度范围内孵育24 h后，4T1细胞的相对存活率均维持在82%以上，显示出可接受的体外生物相容性。
3.3 4T1乳腺癌细胞中的细胞摄取特征：共聚焦显微镜结果显示，IR783-BBN的红色荧光主要分布在4T1细胞的胞质区域。细胞摄取呈现浓度和时间依赖性：随着探针浓度从0.5 μM增加至10 μM，或孵育时间从15 min延长至2 h，细胞内荧光信号逐渐增强。与游离IR783相比，IR783-BBN表现出更强的细胞内荧光信号。
3.4 流式细胞术定量分析：流式细胞术定量结果进一步证实了共聚焦显微镜的观察结果。与未处理对照组相比，IR783-BBN处理组的平均荧光强度显著升高（P<0.0001）。时间依赖性实验显示，细胞内荧光信号随孵育时间（0-2 h）延长而逐步增加；浓度依赖性实验显示，平均荧光强度随探针浓度（0-20 μM）增加而稳步上升。
3.5 体内荧光成像：尾静脉注射IR783-BBN（5 nmol/150 μL）后，在4T1荷瘤小鼠的肿瘤区域可检测到荧光信号。肿瘤区域的荧光强度在注射后1小时达到峰值，随后随时间逐渐下降，但在24 h内仍可检测到。注射后1小时的肿瘤-肌肉荧光比为6.97（n=3）。离体器官成像显示，肿瘤组织相对于心脏、脾脏和肺等非靶器官具有明显的荧光信号，同时在肝脏和肾脏中也观察到较强的荧光信号，提示肝、肾途径可能参与了探针的体内分布和清除。
3.6 IR783-BBN介导的荧光引导术中肿瘤切除：在注射后1小时进行荧光引导手术。术中，肿瘤区域呈现出明显的NIR荧光信号，使荧光阳性的肿瘤组织与周围非荧光组织得以区分。在实时荧光引导下，研究人员对荧光病灶进行了从第1块到第6块的序贯切除。离体荧光成像显示，最初切除的标本荧光信号强，后续标本信号逐渐减弱，第6块标本几乎无荧光信号。H&E染色证实前5块标本含有恶性瘤组织，第6块主要为正常横纹肌和结缔组织，未见明显肿瘤细胞浸润。组织荧光显微成像结果与H&E染色一致，强荧光信号出现在含肿瘤的早期切片中，而在最终的正常组织切片中信号可忽略不计。
总结与讨论
该研究成功合成了一种靶向GRPR的NIR荧光探针IR783-BBN。该探针继承了IR783优异的NIR光学性能和BBN肽的特异性肿瘤识别能力，通过BBN-GRPR结合及随后的受体介导的内吞作用实现靶向肿瘤荧光成像。体外研究显示IR783-BBN在测试条件下对4T1细胞低毒，并能以时间和浓度依赖方式被细胞高效内化。体内成像显示全身给药后可检测到肿瘤相关荧光，离体生物分布也揭示了其在清除器官（特别是肝脏和肾脏）中的荧光信号。所观察到的肿瘤与周围组织的对比度支持了其在4T1模型中进行荧光引导可视化的应用潜力。总体而言，这些发现证明了使用BBN偶联的NIR荧光探针进行肿瘤成像和荧光引导手术导航的可行性。尽管仍需进一步研究以确定受体特异性靶向、药代动力学行为、安全性以及在更大动物队列中的性能，但现有结果为将IR783-BBN发展为一种术中肿瘤成像探针奠定了基础。
